论文摘要
H4亚型AIV属于低致病性毒株,它不仅能感染家禽,引起各种症状,还对哺乳动物,如猪、海豹等有一定的致病性。因此,对它的研究具有重要的公共卫生意义。本研究制备了针对H4亚型AIV血凝素的单克隆抗体,并初步建立了利用单抗检测病毒感染细胞的流式细胞术检测方法。本试验以H4亚型AIV分离株A/Duck/Yangzhou/185/2003为抗原,经过扩增纯化后,分三次免疫8周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0-Ag-14骨髓瘤细胞融合。用血凝抑制试验（HI）筛选阳性杂交瘤细胞,3次克隆化后,获得了4株能够稳定分泌抗体的单克隆细胞株,分别命名为2C11、6E7、4C8和5C5。单抗生物学特性鉴定结果表明,4株单抗腹水的血凝抑制价在2(120～215,免疫球蛋白亚类均为IgG2a。间接免疫荧光（IFA）检测结果表明,4株单抗均能使感染了H4亚型AIV的犬肾细胞（MDCK）呈现亮绿色荧光。单抗特异性鉴定结果表明,4株单抗均不与其他亚型AIV、新城疫病毒（NDV）、传染性支气管炎病毒（IBV）、减蛋综合症病毒（EDS-76）反应。另外,4株单抗与H4亚型AIV中和后均能使病毒失去感染细胞的能力,显示了良好的中和特性。单抗HI反应谱鉴定结果表明:四株单抗能与不同时间、不同地方分离的10株H4亚型AIV中的大部分毒株反应,并且单抗的HI效价普遍高于相应的阳性血清。其中,2C11可以抑制9株病毒的血凝反应,4C8可以抑制8株病毒的血凝反应,而6E7、5C5仅能抑制7株病毒的血凝反应,4株单抗对A/Duck/ Suzhou /1/2002毒株均没有血凝抑制作用。以上结果表明,不同H4亚型AIV毒株的HA抗原性有一定差异。在透射电镜下,A/Duck/Yangzhou/185/2003分离株病毒粒子呈现典型的AIV形态。该毒株体外感染MDCK细胞后,虽然能在细胞内增殖,但是,维持液中加入胰酶后,可以明显地提高感染效率。将病毒感染细胞固定后,利用单抗2C11进行标记后发现,随着感染剂量的增加,阳性细胞数不断增加。本研究所研制的单抗和所建立的以单抗为基础的病毒感染细胞的流式细胞术检测方法,为H4亚型AIV致病机理和检测技术的深入研究奠定了基础。
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