基因免疫制备新城疫病毒磷蛋白的单克隆抗体

论文摘要

制备新城疫病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）的单克隆抗体（以下简称单抗）,如果用全病毒做免疫抗原和筛选抗原,得到的NDV的单抗多是针对该病毒的优势抗原表位;而磷蛋白（P蛋白）是NDV的内部结构蛋白,且其蛋白含量占整个病毒蛋白含量的比例很小,为病毒的非优势抗原表位,如果用全病毒做免疫抗原和筛选抗原,那么能够得到分泌针对P蛋白的单抗的细胞株的可能性很小。 本实验的目的是制备针对P蛋白特异的单抗,供研究P基因的结构和功能使用。我们采用P蛋白基因的真核重组表达质粒作DNA免疫的方法免疫小鼠,而以P基因的原核表达产生的融合蛋白经纯化后作为筛选抗原来制备针对P蛋白的单抗。首先,我们构建了NDVP基因的真核重组表达质粒pcDNA3.1（-）-P;经酶切和PCR鉴定,确定P基因是以正确的方向插入pcDNA3.1（-）后,用脂质体法将其转染入COS-1细胞,于转染后72小时采用间接免疫荧光的方法确定该重组质粒在体外真核细胞中可以表达目的蛋白;然后大量提取质粒,将其作为DNA免疫的材料,免疫6周龄的BALB/C小鼠,每只小鼠腿部肌肉注射裸质粒100gg,隔2周免疫一次,共免疫4次,最后一次加强免疫后7天,取免疫小鼠的脾细胞和处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0-Ag-14进行融合。同时,用原核表达载体pGEX-6p-1构建P基因的的原核表达质粒:经酶切和PCR鉴定后,转化宿主菌BL21,37℃经IPTG诱导表达;将诱导产生的融合蛋白（GST-P）经SDS-PAGE和Western-Blot鉴定后作为筛选包被抗原。通过间接ELISA对融合的杂交瘤细胞进行筛选,将获得的阳性细胞株用有限稀释法进行多次亚克隆后,获得一株分泌针对P蛋白的特异性单抗的细胞株,命名为2G8,细胞上清效价为1:256,腹水效价为1:2×104,亚类鉴定为IgM。用鹅源新城疫病毒ZJ-1株感染鸡胚成纤维细胞做间接免疫荧光试验鉴定2G8的特异性,结果显示了特异性的绿色荧光;Western-Blot结果也显示了单抗的良好特异性。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 综述
• 研究一 免疫原和筛选抗原的制备
• 引言
• 1、材料
• 2、方法
• 3、结果
• 4、讨论
• 研究二 新城疫病毒磷蛋白单克隆抗体的制备
• 引言
• 1、材料
• 2、方法
• 3、结果
• 4、讨论
• 参考文献
• 致谢