酿酒酵母线粒体基质蛋白Mmf1和Mam33的结构功能研究

论文摘要

YjgF/YER057c/UK114是一类在细菌、古生菌和真核细胞中高度保守的蛋白质家族,该家族蛋白质的分子量约为15 kDa,一级序列同源性高达47%至78%,但是它们的生物学功能却具有多样性。如人源蛋白hp14.5被认为是一个转录抑制因子,可以在大鼠网织红细胞裂解物系统内抑制蛋白质合成;大鼠中的rp14具有核糖核酸内切酶的活性;山羊中的UK114则有肿瘤抗原的活性。其它物种的同源蛋白的功能还包括:钙蛋白酶活性（牛）、嘌呤调节活性（枯草芽胞杆菌）、光合作用的活性。到目前为止,该家族已经有二十多个蛋白的结构被解析,但它们的生理功能目前尚不清楚。这些已解析蛋白的总体结构都是三聚体,而且每两个单体之间形成大而深的沟槽,在这些沟槽中有六到九个非常保守的氨基酸,它们可以结合不同的配体,包括:苏氨酸、色氨酸、2-酮丁酸、乙二醇或丙酮。酿酒酵母中的同源蛋白是Mmf1,即线粒体基质因子（mitochondrial matrix factor）,研究表明Mmf1可能参与异亮氨酸的生物合成或参与维持线粒体完整性等相关功能。串联亲和纯化实验的结果显示Mmf1可以与线粒体酸性基质蛋白Mam33相互作用。因其是分子量约为33 kDa的酸性蛋白,又位于线粒体基质中,因此被命名为Mam33。它是在分离与细胞色素b2信号肽有相互作用的蛋白质中被发现的。MAM33基因的敲除会导致酵母在甘油培养基的条件下生长缓慢,但是对葡萄糖培养基中的生长则没有影响,这一结果显示Mam33可能参与了线粒体的氧化磷酸化作用。Mam33的同源蛋白在人源、硕大利什曼原虫、布氏锥虫和秀丽隐杆线虫中为三体或者四体,Mam33与它们的序列同源性约在24–35%之间。人源的Mam33同源蛋白被称为是前体mRNA剪切因子结合蛋白,即p32。p32与维持线粒体氧化磷酸化相关,并通过与不同的配体蛋白结合来执行多种多样的功能。目前,一共有82个配体蛋白被鉴定出与酵母的Mam33有相互作用,其中23个是线粒体中的核糖体蛋白。因而,我们推测Mam33可能在Mmf1的帮助下参与线粒体中核糖体蛋白合成。为了理解酿酒酵母中Mmf1与Mam33之间的相互作用关系,我们对这两个蛋白复合物进行了晶体学研究。虽然我们得到了Mmf1–Mam33复合物蛋白,但是未能长出晶体。但是我们成功解析了Mam33和Mmf1的单体结构,其分辨率分别为为2.10 （A|°）和1.74 （A|°）。进而,我们进行了等温滴定实验、超速离心实验等生化实验。结果显示,Mmf1可以与Mam33组成摩尔比为2比1的复合物。通过对Mmf1和Mam33的结构进行分析,我们发现Mmf1三体表面正电势与Mam33三体表面部分区域形成互补的表面电势,从而可能通过静电相互作用形成复合物。我们据此模拟出一个Mmf1–Mam33复合物的结构,它提供了两个蛋白之间可能的相互作用模式。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 酿酒酵母线粒体基质蛋白 Mmf1 的结构与功能研究
• 第一章 研究背景
• 1.1 引言
• 1.1.1 YER057c/Yjgf/Uk114 基因家族的特点和成员
• 1.1.2 线粒体与氧化还原平衡
• 1.2 Mmf1 蛋白及功能简介
• 1.2.1 Mmf1 蛋白简介
• 1.2.2 Mmf1 的功能研究现状
• 1.3 Mmf1 与其同源蛋白的比较分析
• 1.3.1 YER057c/Yjgf/Uk114 家族蛋白的结构
• 1.3.2 YER057c/Yjgf/Uk114 家族蛋白的功能
• 1.3.3 酿酒酵母中Mmf1 和物种内同源蛋白Hmf1 的比较
• 1.3.4 裂殖酵母中Mmf1 的同源蛋白
• 1.4 与Mmf1 有相互作用的蛋白质
• 1.5 本课题的研究目标和内容
• 第二章 实验材料、设备与方法
• 2.1 实验材料和实验设备
• 2.1.1 实验菌株和质粒
• 2.1.2 实验试剂与酶
• 2.1.3 实验仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 目的基因的重组克隆质粒构建
• 2.2.2 目的蛋白的表达与纯化
• 2.2.3 蛋白质的晶体生长
• 2.2.4 晶体结构解析方法
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 Mmf1 的表达与纯化
• 3.1.1 Mmf1 的引物设计
• 3.1.2 Mmf1 的质粒构建过程
• 3.1.3 Mmf1 蛋白的检测表达
• 3.1.4 Mmf1 蛋白的纯化和浓缩
• 3.2 Mmf1 蛋白的初步晶体学研究
• 3.2.1 Mmf1 蛋白晶体的生长与优化
• 3.2.2 Mmf1 蛋白衍射数据的收集与处理
• 3.3 晶体结构的解析与数据质量分析
• 3.3.1 晶体结构解析
• 3.3.2 晶体质量的评估
• 3.4 Mmf1 的结构描述
• 3.4.1 Mmf1 单体和三聚体晶体结构分析
• 3.4.2 Mmf1 三聚体表面电势的分析
• 3.4.3 Mmf1 蛋白中保守氨基酸
• 3.4.4 Mmf1 可能的六聚体现象
• 3.5 研究展望
• 本章总结
• 第二部分：酿酒酵母线粒体基质蛋白 Mam33 的结构及与 Mmf1 相互作用的研究
• 第四章 背景介绍
• 4.1 引言
• 4.1.1 线粒体
• 4.1.2 线粒体氧化磷酸化
• 4.2 Mam33 蛋白的研究简介
• 4.2.1 Mam33 的发现
• 4.2.2 Mam33 的基本特性
• 4.2.3 Mam33 蛋白的功能研究进展
• 4.3 Mam33 的同源蛋白
• 4.3.1 Mam33 同源蛋白简介
• 4.3.2 Mam33 同源蛋白的结构
• 4.3.3 Mam33 同源蛋白的功能
• 4.4 与 Mam33 相互作用的蛋白质
• 4.5 本课题的研究目标和内容
• 第五章 实验材料、设备与方法
• 5.1 实验材料和设备
• 5.1.1 实验菌株和质粒
• 5.1.2 实验试剂与酶
• 5.1.3 实验仪器设备
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 Mam33 蛋白的表达，纯化，结晶以及结构解析
• 5.2.2 目的蛋白的表达与纯化
• 5.2.3 蛋白质的晶体生长
• 5.2.4 晶体结构解析方法
• 5.2.5 Mam33 蛋白与Mmf1 蛋白的分子筛共纯化实验
• 5.2.6 Mam33 蛋白与Mmf1 蛋白的分子筛共结晶实验
• 5.2.7 Mam33 蛋白与Mmf1 蛋白的等温滴定实验
• 5.2.8 Mam33 蛋白与Mmf1 蛋白的共超离实验
• 第六章 结果与讨论
• 6.1 Mam33 蛋白的表达，纯化和晶体生长
• 6.1.1 Mam33 的引物设计
• 6.1.2 Mam33 的质粒构建过程
• 6.1.3 Mam33 蛋白的检测表达
• 6.1.4 Mam33 蛋白的纯化和浓缩
• 6.1.5 Mam33 蛋白质的浓缩和浓度测定
• 6.2 Mam33 蛋白与 Mmf1 蛋白的分子筛共纯化实验
• 6.3 Mmf1 蛋白的初步晶体学研究
• 6.3.1 Mmf1 蛋白晶体的生长与优化
• 6.3.2 Mam33 蛋白衍射数据的收集与处理
• 6.3.3 Mam33 蛋白衍射数据的收集与处理
• 6.4 晶体结构的解析与数据质量分析
• 6.5 Mam33 蛋白的三维晶体结构
• 6.5.1 Mam33 晶体的单体和三聚体结构分析
• 6.5.2 Mam33 三聚体表面电势的分析
• 6.5.3 Mmf1 与Mam33 共结晶之路
• 6.6 Mam33 蛋白与Mmf1 蛋白的分子筛共纯化讨论
• 6.7 等温滴定实验结果讨论
• 6.8 超速离心实验结果讨论
• 6.9 Mmf1 蛋白与Mam33 蛋白相互作用模式图
• 6.10 研究展望
• 本章总结
• 参考文献
• A. 载体图谱
• B. 大肠杆菌感受态细胞制备方法
• C. 毕赤酵母感受态细胞制备方法
• D.亲和层析以及分子筛层析原理
• E. 培养基的配制
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文与参加的学术会议