淀粉样前体蛋白（APP）的表达与制备以及非修饰性APP/C99细胞模型的建立与应用

论文摘要

阿尔茨海默氏病（Alzheimer’s disease, AD）中,淀粉样前体蛋白（Amyloid precursor protein, APP）的异常酶切是重要病因之一。APP是一种跨膜蛋白,有多种亚型,其中最主要的是APP770/ APP751/ APP695,（770/751/695个氨基酸残基）。在体内经β-分泌酶降解后,形成C端跨膜产物C99,后者再经γ-分泌酶在膜内裂解释放出淀粉样多肽（βamyloid peptide ,Aβ）,该多肽可聚集形成老年斑,具有神经毒性。γ-分泌酶属膜内裂解蛋白酶,其催化组分是PS1。目前APP751/APP695两种全蛋白在原核系统的表达未见报道,并且它们作为膜蛋白在大肠杆菌中表达的亚细胞定位也尚未有过报道。本实验首先分别构建了重组载体APP770/APP751/APP695/APP695MC/C99-pET28a（+）,确定了最佳表达条件,并首次对大肠杆菌表达的APP膜蛋白进行了亚细胞的鉴定。在pH11.5的条件下,经超速离心获得表达菌的膜性成分,Western blot鉴定表明这些表达产物（包括APP770/APP751/APP695/APP695MC/C99）可以插入到大肠杆菌的膜上。基于自然界中生物膜融合的基础,本论文在获得了APP的膜性成分的基础上,分析了APP770/APP751/APP695/APP695MC/C99的膜性成分与PC12细胞和HEK293细胞的融合作用。经过免疫荧光分析、Western blot鉴定及电镜观察,这些APP可以同靶细胞融合,从而建立了非修饰的细胞模型。利用该细胞模型,分析了膜性C99与靶细胞融合后,对于细胞产生Aβ的影响。结果表明,在PC12及HEK293细胞内,磷酸化的C99与外源的非修饰的C99相比,Aβ的产量要明显增高。该研究结果为防治阿尔茨海默氏病的研究提供了实验依据和理论基础。

论文目录

• 内容提要
• 前言
• 1. APP 的结构
• 2. APP 与 AD 关系
• 3. APP/C99 水解酶—γ-分泌酶
• 4. APP/C99 水解酶—γ-分泌酶中的活性组分 PS1
• 5. APP 的原核表达产物研究现状
• 第一章 淀粉样前体蛋白（APP）在大肠杆菌中的表达与纯化
• 1. 实验材料
• 2. 实验方法
• 3. 实验结果
• 3.1 目的基因的获得
• 3.2 表达载体的构建
• 3.3 目的蛋白的表达与纯化
• 3.4 表达产物的胰蛋白酶抑制活力
• 3.5 目的蛋白的表达特性鉴定
• 讨论
• 小结
• 第二章 非修饰性 APP/C99 细胞模型的建立
• 1. 实验材料
• 2. 实验方法
• 3. 实验结果
• 3.1 表达载体 APP770/APP751/APP695/APP695MCC/C99- pcDNA3.1（+） 的构建
• 3.2 PC12、HEK293 细胞内源性 APP 水平检测及亚细胞定位
• 3.3 APP770/APP751/APP695/APP695MCC/C99-pcDNA3.1 转染靶细胞中外源 APP/C99 的表达与表达部位分析
• 3.4 APP770/APP751/APP695/APP695MC/C99 结合的膜片段与 HEK293细胞的融合
• 3.5 大肠杆菌表达的 APP770/APP751/APP695/APP695MC/C99 结合的膜片段与 PC12 细胞的融合
• 3.6 抗人 Aβ抗体（β-Amyloid（B-4））抗体)对 APP770/APP751/APP695/APP695MC/C99 结合的膜片段与 PC12、HEK293 细胞融合的影响
• 3.7 纯化的 APP695 与靶细胞的“融合”
• 3.8 APP751 膜成分与 PC12 细胞融合的电镜观察
• 讨论
• 小结
• 第三章 非修饰性 APP/C99 细胞模型的初步应用
• 1. 实验材料
• 2. 实验方法
• 3. 实验结果
• 3.1 PS1 目的基因的获得及 PS1-pEGFP-C3 重组表达载体的构建
• 3.2 分析修饰/非修饰的 C99 在 PC12 及 HEK293 细胞中对 Aβ产生水平的影响
• 讨论
• 小结
• 全文结论
• 参考文献
• 博士期间发表的学术论文
• 中文摘要
• Abstract
• 致谢