论文摘要
背景和目的肿瘤的发生发展是环境因素与宿主因素相互作用的结果，细胞对致癌物质的敏感性和自身突变的修复能力直接影响癌变发生的概率。DNA聚合酶β（DNApolymerseβ，polβ）是真核细胞DNA聚合酶家族的一员，为一看家基因，是重要的修复酶之一。从酵母到哺乳类细胞polβ均高度保守，并且广泛分布于哺乳动物细胞内。polβ基因全长35kb，位于第8号染色体近着丝点处，是单拷贝基因，有14个外显子及13个内含子。该聚合酶的表达产物是相对分子质量为39KD的单链小分子蛋白，是真核细胞中相对分子质量最小的DNA聚合酶。它的主要功能是参与DNA损伤修复，尤其是在碱基切除修复（base excision repair，BER）的过程中填补单核苷酸缺口。自从重组全DNA技术克隆出了DNA聚合酶βcDNA以后，它的生物学功能越来越受到人们的关注。近年来许多学者对DNA polβ在肿瘤组织及细胞系中的突变及表达状态等进行了系统研究，为揭示肿瘤发生的分子机制，提供了一个新的切入点。目前，针对polβ在人类肿瘤中突变、表达的生物学效应方面的研究正在逐渐深入。通过转染野生型polβ基因可以提高正常polβ的表达；转染siRNA降低突变型或野生型polβ的表达；或者寻找其它针对polβ基因的生物调节剂，来调节或弥补异常或突变修复基因polβ的表达水平。但是，严重制约这一目标实现的关键是国内尚无DNA聚合酶β基因敲除细胞株，在未敲除细胞内进行的一切研究都有不同程度的本底细胞polβ表达的干扰，所得到的实验数据和结果都不能真实反映目的polβ的客观生物学效应。本课题采用基因敲除技术，构建了食管癌Eca9706细胞polβ基因敲除重组载体，将其导入食管癌Eca9706细胞中，经筛选和培养后，检测靶细胞中polβmRNA表达情况及polβ基因敲除区段DNA存在情况，成功构建出食管癌Eca9706细胞DNA聚合酶β基因敲除的细胞模型，为进一步研究polβ的功能打下坚实的实验基础。方法根据GenBank中polβ基因序列（M13140），利用UCSC（University of CaliforniaSanta Cruz）Genome Bioinformatics中Blat分析工具分析polβ基因的所有内含子、外显子和启动子序列；选择polβ敲除序列的上游和下游同源区；设计并合成上游同源重组区（UP）和下游同源重组区（DOWN）的PCR扩增引物；提取食管癌Eca9706细胞基因组DNA；PCR分别扩增得到上游（UP）和下游（DOWN）同源序列；分别克隆入T载体；利用α互补和以T7／SP6为引物PCR扩增筛选鉴定重组子pGEM-T-UP和pGEM-T-DOWN；对插入序列进行DNA序列分析；用XholⅠ／ApaⅠ双酶切重组子pGEM-T-UP；用BglⅡ／HindⅢ双酶切重组子pGEM-T-DOWN及骨架载体pcDNA3.1，分别回收小片段UP，DOWN和大片段骨架载体pcDNA3.1；将双粘片段DOWN和UP分别亚克隆入骨架载体pcDNA3.1中，得到基因敲除重组载体pOUT-down-up；用EcoRV酶切，线性化基因打靶重组载体pOUT-down-up；电穿孔导入食管癌细胞Eca9706中；G-418筛选neo抗性细胞分别用PCR和RT-PCR鉴定polβ基因敲除区段DNA存在情况以及敲除细胞polβmRNA表达情况。结果1．PCR扩增Eca9706细胞基因组DNA，得到上游（UP）和下游（DOWN）同源序列，电泳可见两条明亮条带，分别位于约1268bp和1756bp处，与设计一致。2．PCR产物分别与pGEM-T连接后，转化DH5a，筛选鉴定后得到重组子pGEM-T-UP和pGEM-T-DOWN。对插入片段DNA序列测序，结果与设计完全一致。3．亚克隆后，得到基因敲除载体pOUT-down-up，酶切和PCR扩增鉴定基因敲除重组载体正确。4．线性化基因敲除重组载体pOUT-down-up，导入食管癌Eca9706细胞中，G-418筛选6周，得到含有基因敲除重组载体并携带neo抗性的Eca9706细胞。5．PCR鉴定证实，靶细胞中polβ基因打靶片段已被敲除，RT-PCR方法检测不到polβmRNA的表达。结论1．成功构建出针对polβ的基因敲除重组载体pOUT-down-up。2．筛选得到DNA聚合酶β基因敲除的食管癌细胞株（Eca9706），为深入研究polβ的生物学功能，提供细胞模型。