一种新的金龟子绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶的纯化、特性及基因克隆

论文摘要

本文以金龟子绿僵菌蝗变种（Metarhizium anisopliae var. acridum ）CQMa102菌株为研究材料,用酪蛋白从液体培养基中诱导出一条pI为9.45的磷酸酶,纯化后酶特性研究表明是一种嗜热酶。该酶的氨基酸序列分析表明其与真菌碱性磷酸酶同源,但其底物特异性、酶抑制剂的专一敏感性和含有酪氨酸蛋白磷酸酶的标志序列证明这是一个新的酪氨酸蛋白磷酸酶。而且,该酶在体外能改变其寄主（蝗虫）血淋巴中与信号传导相关的蛋白（Toll-like receptor）的磷酸化状态,进而可能干涉寄主体内免疫活动,这为设计和改造新的真菌杀虫剂提供一种新的技术途径,具有重要的理论与应用价值。全文的主要结论如下:一、发酵条件研究采用单因子实验分析培养条件对绿僵菌生长及产酸性磷酸酶的影响,结果表明,有机氮、葡萄糖和蛋白有机磷有利于绿僵菌生长和产酸性磷酸酶。酸性磷酸酶同工酶分析表明,酪蛋白作为磷源培养绿僵菌时,有一条比较特别的磷酸酶带出现,其pI为9.45,明显不同于其他磷源。因此,我们选择了这条磷酸酶带为我们纯化的目标。根据实验结果确定了纯化目标蛋白的培养条件为:葡萄糖,20g/L;（NH4）2SO4,2g/L;酪蛋白,4g/L;KCl,0.5g/L;MgSO4,0.5g/L;微量元素混合液,10ml/L;接种量,1×107孢子/100ml培养基;装液量,100ml;10g/LMES,pH 6.0;在27°C条件下振荡（160rpm）培养78h。二、蛋白纯化及特性研究培养液经过ConA-Sepharose亲和层析、HighQ阴离子交换层析和25S阳离子交换层析后,得到均一性好,纯度高的目标蛋白,回收率达41%。电泳法测定蛋白的pI为9.45,分子量为82.5kDa,用TMSF去糖基后表观分子量为69kDa,因此该蛋白含碳水化合物16.4%。酶底物特异性研究表明该磷酸酶对磷酸酪氨酸残基底物专一性强,而且丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶抑制剂（EDTA、NaF和冈田酸）、酸性磷酸酶抑制剂（EDTA、酒石酸钠）和碱性磷酸酶抑制剂（EDTA）对酶酶解pNPP和O-phospho-L-tyrosine活性没有明显的抑制作用;但酪氨酸蛋白磷酸酶抑制剂（钼酸钠、原钒酸钠、N-乙基马来酰亚胺和钨酸钠）显著抑制酶对O-phospho-L-tyrosine的酶解活性,因此该磷酸酶应该是酪氨酸蛋白磷酸酶。该酶的最适作用温度大约是75°C,最适pH是5.5,热稳定性及pH稳定性好。除Ni2+外,Ca2+、Co2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Mn2+和Ba2+在5mM以上都明显抑制酶降解pNPP的活性。Zn2+、Fe2+、Cu2+和Ag+显著抑制酶水解O-phospho-L-tryosine的活

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 绪论
• 1.1 虫生真菌的侵染循环
• 1.2 绿僵菌杀虫机理研究进展
• 1.2.1 绿僵菌对寄主的识别与粘附
• 1.2.2 绿僵菌侵入寄主机理
• 1.2.3 绿僵菌进入寄主体内后的作用机制
• 1.3 磷酸酶研究现状
• 1.3.1 碱性磷酸酶
• 1.3.2 酸性磷酸酶
• 1.3.3 丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶
• 1.3.4 酪氨酸蛋白磷酸酶（Protein tyrosine phosphatases, PTPs, EC3.1.3.48）
• 1.3.5 磷酸酶在病原菌侵入寄主中的作用
• 1.4 本研究的目的意义
• 1.5 研究内容及技术路线
• 1.5.1 主要研究内容
• 1.5.2 研究的技术路线
• 1.6 本文的创新点
• 2 培养条件对绿僵菌产胞外磷酸酶的影响
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验菌株及基本培养基
• 2.2.2 主要仪器设备
• 2.2.3 主要溶液及配制
• 2.2.4 供试菌株培养及分生孢子悬浮液的制备
• 2.2.5 酸性磷酸酶活性测定方法
• 2.2.6 绿僵菌生物量测定方法
• 2.2.7 培养条件对绿僵菌产酸性磷酸酶和生物量的影响
• 2.2.8 粗酶液的制备及蛋白浓度的测定
• 2.2.9 垂直等电聚焦电泳及酸性磷酸酶同工酶分析
• 2.2.10 粗酶液的酸性磷酸酶活性的热稳定性
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 培养基pH、绿僵菌接种孢子浓度和通气效率对绿僵菌产酸性磷酸酶和生物量的影响
• 2.3.2 不同碳源和氮源对绿僵菌产酸性磷酸酶和生物量的影响
• 2.3.3 无机磷不同起始浓度对绿僵菌产酸性磷酸酶和生物量的影响
• 2.3.4 不同磷源对绿僵菌产酸性磷酸酶及生物量的影响
• 2.3.5 在优化培养条件下绿僵菌生长及酸性磷酸酶活性随培养时间的动态变化
• 2.3.6 温度对粗酶液中磷酸酶活性的影响
• 2.4 问题与讨论
• 2.4.1 当用酵母膏、蛋白胨和牛肉浸膏培养时蛋白酶活性高，而用酪蛋白培养时产生的蛋白酶活性很低，甚至比只用低无机磷培养时还低
• 2.4.2 绿僵菌在不同磷源条件下产生不同的磷酸酶
• 2.4.3 在粗酶液的热稳定性实验中，粗酶液中的有部分酸性磷酸酶活性在20℃ 的条件下也很快丧失
• 2.4.4 粗酶液在60℃、70℃ 和75℃ 水浴过程中，从15min 到225min 期间，酸性磷酸酶的活性持续上升。而在50℃ 水浴时，酶活性从225min 才开始上升
• 2.5 本章小结
• 3 绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶的纯化及其特性研究
• 3.1 引言
• 3.1.1 蛋白分离纯化及特性研究的目的意义
• 3.1.2 蛋白分离纯化常用的方法与策略
• 3.1.3 本实验的原则和纯化技术路线
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验菌株及培养条件
• 3.2.2 主要仪器设备
• 3.2.3 主要试剂
• 3.2.4 主要溶液及配制
• 3.2.5 酸性磷酸酶活性及酪氨酸蛋白磷酸酶活性分析测定
• 3.2.6 待纯化样品的制备
• 3.2.7 ConA-Sepharose 48 亲和层析
• 3.2.8 离子交换层析
• 3.2.9 天然等电聚焦凝胶电泳（IEF-PAGE）及磷酸酶等电点（pI）测定
• 3.2.10 天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 及表观分子量的测定
• 3.2.11 磷酸酶特性研究
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 酶的纯化
• 3.3.2 酶纯度鉴定和酶分子量及等电点测定
• 3.3.3 酶的底物特异性
• 3.3.4 酶的最适温度及其热稳定性分析
• 3.3.5 金龟子绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶的最适pH 及其pH 稳定性分析
• 3.3.6 酶的动力学特性——米氏常数（Km）分析
• 3.3.7 磷酸酶特异抑制剂对酶活性的影响
• 3.3.8 金属离子对酶活性的影响
• 3.3.9 无机磷对酶活性的反馈抑制
• 3.3.10 酶的糖基含量分析
• 3.4 问题与讨论
• 3.4.1 蛋白分离纯化策略的制定
• 3.4.2 酶蛋白纯度的鉴定
• 3.4.3 磷酸酶的类型确定
• 3.4.4 酶的热稳定性
• 3.5 本章小结
• 4 绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶的基因克隆及分析
• 4.1 引言
• 4.1.1 基因克隆的意义
• 4.1.2 基因克隆常用方法
• 4.1.3 本实验克隆绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶的基因的技术路线
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 主要仪器设备
• 4.2.2 主要质粒、试剂及培养基
• 4.2.3 主要溶液及配制
• 4.2.4 酶蛋白的鉴定
• 4.2.5 绿僵菌总DNA 提取分离、定量及检测
• 4.2.6 绿僵菌全基因组文库的构建
• 4.2.7 大肠杆菌（JM109）感受态的制备及转化
• 4.2.8 PCR 产物的琼脂糖凝胶回收
• 4.2.9 绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶基因的文库筛选
• 4.2.10 绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶基因的cDNA 克隆
• 4.2.11 引物合成及核酸序列测定
• 4.2.12 绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶基因及氨基酸序列特性分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 酪氨酸蛋白磷酸酶的肽质量指纹分析图谱及其搜索比对结果
• 4.3.2 绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶的多肽de novo 测序
• 4.3.3 绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶基因PCR 扩增
• 4.3.4 酪氨酸蛋白磷酸酶基因的3’-RACE 和5’-RACE cDNA 序列克隆
• 4.3.5 金龟子绿僵菌基因组文库的构建及其质量评估
• 4.3.6 绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶基因的文库筛选
• 4.3.7 蛋白氨基酸序列相似性及其糖基化、磷酸化位点等性质分析
• 4.4 问题与讨论
• 4.4.1 未知蛋白的鉴定
• 4.4.2 该磷酸酶基因克隆中的问题与方法
• 4.4.3 酪氨酸蛋白磷酸酶基因序列分析
• 4.5 本章小结
• 5 蝗虫血淋巴中绿僵菌 PTPase 的靶标分析
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 东亚飞蝗
• 5.2.2 主要仪器设备
• 5.2.3 主要试剂及配制
• 5.2.4 蝗虫血淋巴的收集
• 5.2.5 蝗虫血浆的磷酸化蛋白的亲和层析
• 5.2.6 蛋白浓度的测定
• 5.2.7 蝗虫血淋巴与纯化的PTPase 作用
• 5.2.8 双向电泳
• 5.2.9 PDQUEST 软件分析蛋白差异点
• 5.2.10 肽指纹图谱分析
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 凝胶图谱匹配性分析
• 5.3.2 凝胶图谱重复性分析
• 5.3.3 磷酸化蛋白差异点分析
• 5.3.4 差异点蛋白MALDI-TOF-MS 质谱分析及比对结果
• 5.4 讨论
• 6 主要研究结论及后续研究建议
• 6.1 主要研究结论
• 6.1.1 培养基pH、孢子接种浓度、通气效率不同的氮源和碳源及磷源对绿僵菌生长及产酸性磷酸酶都有很大影响
• 6.1.2 蛋白纯化及特性研究
• 6.1.3 酪氨酸蛋白磷酸酶基因克隆及分析
• 6.1.4 蝗虫血淋巴中绿僵菌PTPase 的靶标分析
• 6.2 后续工作建议
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读博士学位期间论文发表的论文目录
• 独创性声明
• 学位论文版权使用授权书