重组sCD83和sBTLA对DC活性及sCD83对同种皮肤移植物存活的影响

论文摘要

一、前言移植排斥反应是导致临床同种移植术失败的主要原因。一般认为，T细胞应答及其效应是介导移植排斥反应发生的主要机制。双信号假说认为T细胞活化需两个信号：信号1由TCR识别APC表面的抗原肽-MHC复合物（p-MHC）所启动；信号2由T细胞和APC间共刺激分子的相互作用所启动。两个信号的整合可最有效地诱导T细胞活化，而缺乏共刺激信号可致T细胞应答下降，某些情况下可诱导耐受或T细胞失能（anergy）。近年来，对共信号分子（co-signalling molecule）的研究不断深入，并对双信号学说形成挑战。Chen Lieping提出T细胞活化的共信号网络学说，其要点是：虽然TCR信号是T细胞活化所必需，但并不能决定T细胞活化的方向，而共信号（共刺激信号和/或共抑制信号）才是引导抗原特异性T细胞应答的关键。根据该理论，阻断T细胞活化的共刺激信号或增强共抑制信号，均可负调节T细胞活性，从而诱导T细胞产生免疫耐受。抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）介导的抗原提呈是T细胞识别同种抗原的关键环节。目前认为，树突状细胞（dendritic cell，DC）成熟状态在T细胞识别同种抗原中起重要作用，并直接影响免疫应答的强度和类型：成熟DC表面表达多种共刺激分子（如CD80、CD86、CD40等）、黏附分子（如CD54、CD58等）和MHCⅠ和Ⅱ类分子，其功能主要是诱导免疫应答；未成熟DC低表达共刺激分子、黏附分子和MHC分子，其诱导T细胞激活的能力很弱，可能在免疫耐受形成中发挥重要作用。CD83属免疫球蛋白超家族，与B7家族成员具有一定同源性，是成熟DC的表面标志，其生物学功能尚未完全清楚。已发现，伴随DC成熟，其表面CD83与其他共刺激分子（CD80、CD86）的表达亦升高，提示CD83具有重要生物学功能。文献报道，CD83在T细胞成熟和活化中起重要作用，其实验依据为：①可溶性CD83可抑制T细胞活化，提示CD83可能是参与T细胞活化的共刺激分子之一；②可溶性CD83可抑制DC表达共刺激分子，并下调DC的共刺激活性，从而抑制DC对T细胞的活化。BTLA（B and T lymphocyte attenuator，BTLA）是最近发现的CD28家族成员，与该家族另两个抑制性受体（CTLA4、PD1）有相似分子结构。研究发现，BTLA参与维持自身耐受，并是下调Th1细胞活性的重要因子，相关实验依据为：①BTLA主要表达于活化的T和B细胞表面，尤其持续高表达于Th1细胞表面；②BTLA缺陷动物易诱发EAE。最近发现，“疱疹病毒进入介质”（herpesvirus entry mediator，HVEM）是BTLA的配体，BTLA结合HVEM的部位与LIGHT不同，但与疱疹病毒糖蛋白D（Herpesvirus glycoprotein D，gD）的结合部位相重叠。已证实，HVEM与T细胞表面BTLA结合，可启动正向信号而抑制T细胞活化，其机制尚不清楚。有关HVEM-BTLA途径介导反向信号对HVEM表达细胞的影响，迄今尚未见报道。鉴于可溶性CD83具有抑制T细胞增殖和抑制DC共刺激活性的双重作用，本课题探讨可溶性CD83延长同种皮肤移植物存活的作用，并初步探讨其机制，以期为将CD83应用于临床治疗移植排斥反应提供理论和实验依据。另外，本研究克隆小鼠BTLA基因，探讨HVEM-BTLA反向信号对DC表达共刺激分子的影响，为将BTLA作为抗移植排斥反应的分子靶点提供理论和实验依据。二、小鼠CD83、BTLA和人IgG1αFc基因克隆和真核表达载体构建采用TRIzol试剂提取小鼠脾脏和人外周血单个核细胞总RNA，经RT-PCR扩增小鼠CD83和BTLA基因以及人IgGlαFc（hIg）基因，并克隆至pcDNA3.1（+）载体中。构建pmCD83-hIg和pmBTLA-hIg表达载体，经酶切和DNA序列测定鉴定，结果表明：成功克隆了小鼠CD83、BTLA胞外功能区基因和hIg基因，成功构建了表达小鼠CD83或BTLA胞外功能区与人IgGlαFc融合蛋白（mCD83-hIg或mBTLA-hIg）的真核表达载体。三、可溶性mCD83-hIg的制备及生物学功能的研究采用Lipofectamine TM2000将pmCD83-hIg载体转染COS-7细胞，在COS-7细胞中表达可溶性mCD83-hIg融合蛋白；采用Western blot、ELISA检测COS-7细胞培养上清中所表达的mCD83-hIg融合蛋白，并用人IgG作为标准品对mCD83-hIg进行定量检测；采用RT-PCR检测mCD83-hIg融合基因mRNA表达。结果表明：转染pmCD83-hIg的COS-7细胞培养上清液可与抗小鼠CD83抗体形成明显条带，其分子量约39.8kD，与预期结果相一致；转染后前4天细胞培养上清中融合蛋白表达量增高较快，但5～7天仅有轻度增高，最高达380μg/L；转染pmCD83-hIg的COS-7细胞可表达mCD83-hIg融合基因mRNA，在约120bp处呈现一明显条带，与预期结果一致。采集转染pmCD83-hIg的COS-7细胞培养上清液，借助Protein A shepharose CL-4B亲和层析柱纯化mCD83-hIg融合蛋白；经浓缩透析，借助SDS-PAGE鉴定融合蛋白纯度，纯化的融合蛋白在约39.8kD处形成一条带，提示纯化蛋白纯度较高，可用于后续实验研究。借助倒置显微镜观察小鼠DC细胞系（DC2.4）形态；FCM鉴定其表面标志。结果显示：DC2.4呈典型树突状细胞形态，表面高表达CD83、CD80和CD86，表明DC2.4为成熟的小鼠DC，可作为DC研究的细胞模型。将mCD83-hIg加入到DC2.4培养体系中，72小时后应用PI染色，FCM检测DC细胞周期和细胞凋亡，并检测DC表面共刺激分子表达、IL-12产生及其刺激同种T细胞活化的能力。结果显示：mCD83-hIg对DC2.4细胞周期和细胞凋亡无影响，但可下调CD83、CD80和CD86表达，显著抑制LPS刺激的IL-12产生，并显著抑制DC2.4的共刺激活性。分离BALB/c小鼠脾脏T细胞作为反应细胞，C57BL/6小鼠脾细胞作为刺激细胞，进行单向MLR，以检测mCD83-hIg对同种T细胞增殖的影响。结果发现：mCD83-hIg可显著抑制T细胞增殖，抑制IL-2和IFN-γ产生，并呈剂量依赖性，但对IL-4和IL-10产生无影响。以上结果说明：可溶性mCD83-hIg可抑制DC表面共刺激分子表达，抑制LPS诱导的IL-12产生，从而抑制DC的共刺激活性；可溶性mCD83-hIg也可抑制T细胞增殖和产生IL-2、IFN-γ。因此，可溶性CD83可分别作用于DC和T细胞，从而对T细胞应答发挥双重调节作用。四、mCD83-hIg延长同种皮肤移植物存活时间的实验研究建立小鼠同种皮肤移植模型。在皮肤移植前1天、移植后第1天和第3天，分别用可溶性mCD83-hIg处理皮肤移植受者，观察皮肤移植物存活时间，并以人IgG和PBS作为对照。结果发现：mCD83-hIg处理组移植物平均存活时间为（12.57±2.07）天，人IgG对照组为（8.57±1.51）天，PBS对照组为（8.71±1.11）天，mCD83-hIg处理组皮肤移植物存活时间显著长于对照组（P＜0.01）。移植后第7天，取移植皮片进行组织学分析，并借助RT-PCR检测某些细胞因子mRNA表达；取受者外周血检测血清某些细胞因子水平；取供者脾细胞再次刺激受者脾脏T细胞，检测后者对供者同种抗原的再次应答能力。结果发现：①mCD83-hIg处理组皮肤移植物中炎性浸润明显低于对照组，对照组皮肤移植物中有较多炎性细胞浸润，主要为单个核细胞，且毛细血管严重充血，出血，组织出现小溃疡灶；②mCD83-hIg处理组皮肤移植物中炎性细胞因子IL-2和IFN-γmRNA表达显著低于对照组（P＜0.01或P＜0.05），但各组间IL-4和IL-10mRNA表达无差异；③mCD83-hIg处理组受者血清IL-2和IFN-γ水平也显著低于对照组（P＜0.01），各组间血清IL-4和IL-10水平亦无有差异；④mCD83-hIg处理组受者脾脏T细胞对供者脾细胞再刺激的增殖活性显著低于对照组。以上研究结果表明：可溶性CD83在体内可抑制同种T细胞活化，抑制Th1型细胞分化和细胞因子产生，从而延长同种皮肤移植物存活。提示：可溶性CD83在治疗移植排斥反应中可能具有较好应用前景。五、重组GST-mBTLA融合蛋白的表达及抗血清的制备构建谷胱甘肽-S-转移酶—小鼠BTLA胞外功能区融合基因（GST-mBTLA）的重组质粒：在E．coli BL21（DE3）中表达重组GST-mBTLA融合蛋白；借助Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化重组蛋白，经SDS-PAGE鉴定，纯化的重组蛋白达到电泳纯；将重组蛋白免疫家兔，制备兔抗GST-mBTLA血清，其双扩散效价为1：16，ELISA效价为1：3200。六、可溶性mBTLA对DC表面共刺激分子表达的影响将pmBTLA-hIg载体转染DC2.4细胞，筛选稳定表达细胞株。采用Western blot、ELISA检测细胞培养上清中mBTLA-hIg融合蛋白含量，并用人IgG作为标准品定量检测mBTLA-hIg；借助RT-PCR检测mBTLA-hIg融合基因mRNA表达。结果表明：稳定转染pmCD83-hIg的DC2.4细胞培养上清液可与抗mBTLA抗体形成明显条带，其分子量约43.3kD，与预期结果相一致：1×104pmBTLA-hIg稳定转染的DC2.4，（在2.5ml培养基中）所分泌mBTLA-hIg融合蛋白水平呈时间依赖性，最高达230ug/L；借助RT-PCR，证明转染pmBTLA-hIg的DC2.4可表达mBTLA-hIg融合基因mRNA，在约175bp处呈现一明显条带，与预期结果一致。将稳定表达mBTLA-hIg的DC2.4培养72小时，经PBS洗涤，用FITC标记的抗人IgG1单抗染色，借助FCM检测细胞表面是否结合mBTLA-hIg。结果表明：稳定表达mBTLA-hIg的DC2.4能与FITC标记的抗人IgG1抗体结合，说明mBTLA-hIg可结合到DC2.4表面；借助FCM分析稳定表达mBTLA-hIg的DC2.4表面共刺激分子表达，发现CD80表达高于未转染细胞，而CD86表达低于未转染细胞；将GST-mBTLA融合蛋白加入未转染DC2.4培养体系中，借助FCM检测共刺激分子表达，发现GST-mBTLA融合蛋白可上调DC2.4表面CD80表达，并呈剂量依赖性，但GST-mBTLA对DC2.4表面CD86表达无影响。进一步在DC培养体系中加入兔抗小鼠GST-mBTLA血清，检测抗血清的阻断效应，结果发现：可溶性mBTLA对DC表面共刺激分子表达的影响可被兔抗小鼠GST-mBTLA血清所阻断。上述结果说明：可溶性mBTLA可调节DC表面共刺激分子表达，即可调节DC的共刺激活性，该效应可能是HVEM-BTLA反向信号作用于DC的结果。进一步研究BTLA对DC生物学行为的影响及其分子机制，不仅具有重要理论意义，也可望为探寻干预免疫相关疾病的策略提供理论和实验依据。七结论1．可溶性CD83的生物学效应为：①下调DC表面共刺激分子表达和IL-12产生，从而抑制DC的共刺激活性；②通过抑制T细胞增殖、Th1型细胞分化和细胞因子产生，从而在DC和T细胞两个调节点对免疫应答起负性调节作用。2．给予可溶性mCD83-hIg可延长小鼠同种皮肤移植物存活时间，提示其可能是一种有效的免疫抑制剂，并可望在治疗移植排斥反应和自身免疫病中具有应用前景。3．可溶性mBTLA可调节DC表面共刺激分子表达，该效应可能是HVEM-BTLA途径反向信号作用的结果。

论文目录

• 主要缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 一、共信号分子和移植免疫
• 二、树突状细胞与移植免疫
• 三、CD83研究进展
• 四、BTLA研究进展
• 六、本课题研究目的和意义
• 第一部分 小鼠CD83和BTLA基因克隆和真核表达载体的构建
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 第二部分 可溶性mCD83-hIg融合蛋白的制备及其体外效应的研究
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 第三部分 mCD83-hIg延长同种皮肤移植物存活时间的实验研究
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 第四部分 pGEX-4T-2/mBTLA载体构建、重组蛋白表达及抗血清制备
• 实验材料
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 第五部分 可溶性小鼠BTLA对树突状细胞表面共刺激分子表达的影响
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 全文总结
• 一、可溶性CD38延长同种皮肤移植物存活时间的研究
• 二、可溶性BTLA对Dc表面共刺激分子表达的调节作用
• 参考文献
• 附1.综述:BTLA——CD28家族一个新的共抑制分子
• 附2.待发表的论文和基金项目
• 致谢