乙型脑炎病毒四川株的分离鉴定及其生物学特性研究

论文摘要

乙型脑炎（Japanese encephalitis, JE）是由黄病毒科的乙型脑炎病毒（JEV）引起的以蚊虫为媒介传播的人畜共患病毒性疾病,猪是JEV的扩增宿主,带毒猪是本病的主要传染源,因此,防制猪患乙脑不但可以减少养猪业的损失,而且也是防制乙脑的重要措施。本研究旨在从四川地区分离猪乙型脑炎病毒,并且对分离株进行系统的生物学特性研究,为乙型脑炎的流行病学调查和分类学研究提供素材,并为有效地防控型乙脑提供理论依据。研究内容如下：1.乙型脑炎病毒四川株的分离与鉴定乙型脑炎病毒的分离：从四川多个地区猪场采集流产死胎及蚊虫样本30余份,将病料处理后接种BHK21细胞及3-5日龄乳鼠,细胞盲传至第4代时,接种采自崇州和内江猪场蚊虫样本的细胞出现细胞堆积、变圆变亮、死亡等疑似JEV病变,96hCPE即达到95%,随着传代代数的增加,细胞病变更加稳定；采用乳鼠对崇州及内江病料进行脑内接种,崇州株接种第三代后3天开始发病,内江株则是第五代开始发病。症状均为离群、拒乳、抽搐、发热、消瘦,至96-120 h出现毛耸、颤抖、强直、肢体痉挛、神经系统兴奋性增强。随着时间的推移,症状逐渐加剧,最终转为麻痹而死亡,其死亡率均为100%,剖检可见脑部充血、水肿。两株JEV疑似株的鉴定：以终点稀释法将病毒液进行初步纯化；对所分离病毒进行电镜超微结构观察、中和实验、琼扩实验、间接免疫荧光实验、间接ELISA实验、以及保守区序列测定。结果为：细胞超薄切片电子显微镜下观察可见60nm左右病毒颗粒；所分离病毒能被JEV阳性血清所中和；琼扩实验、间接免疫荧光实验、间接ELISA实验均呈阳性反应；经PCR均可扩增出其Prm-E基因的高保守区（439bP）。以上试验证实本试验所分离到的病毒为JEV,崇州株命名为CZ-1株,内江株命名为NJ-1株。2.四川分离株的生物学特性分析病毒的核酸类型实验证明CZ-1株和NJ-1株均为RNA病毒；有血凝性；理化实验实验证实该两株病毒均对乙醚、氯仿和去胆酸盐敏感,为囊膜病毒,在PH3-5条件下病毒颗粒易失活,经胰蛋白酶处理后其感染力明显下降,60℃加热60min、100℃加热3min均可使其灭活。CZ-1株和NJ-1株病毒TCID50值分别为10-6.206/0.025ml和10-5.215/0.025mL；对3-5日龄乳鼠的致死性均为100%,对9-11g小鼠,无论脑内、皮下、腹腔毒力都差距不大,但对14-16g较大日龄小鼠的皮下毒力则差别明显。取小鼠脑、心、肝、肺、脾、肾等脏器组做组织切片,镜下观察可见病毒除了造成脑膜内炎性细胞浸润,脑组织内神经细胞变性坏死外,还侵害乳鼠肝、肺、心、肾等组织,造成实质器官的病变,其中cz-1株脑部出现明显的软化坏死灶。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一部分 文献综述
• 1 乙型脑炎病毒的病原学特性
• 1.1 乙型脑炎病毒培养特性
• 1.2 乙型脑炎病毒的分子生物学特性
• 1.3 乙型脑炎病毒的分型
• 1.4 乙型脑炎病毒的致病机制
• 2 乙型脑炎病毒的流行情况
• 3. 乙脑病毒的危害
• 4. 乙脑病毒的诊断方法
• 4.1 乙型脑炎病毒的分离鉴定
• 4.2 血清学检测
• 4.2.1 传统的血清学方法
• 4.2.2 酶联免疫法
• 4.2.3 免疫荧光法
• 4.2.4 滴金免疫法
• 4.3 分子生物学诊断方法
• 4.3.1 RT—PCR
• 4.3.2 套式RT—PCR（RT—Nested—PCR）
• 4.3.3 实时荧光PCR（Real—Time PCR）
• 研究目的与意义
• 第二部分 实验研究
• 第一章 日本乙型脑炎病毒四川株的分离与鉴定
• 1 材料
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 样品
• 1.1.2 细胞系与实验动物
• 1.2 主要试剂及配制
• 1.2.1 细胞培养基
• 1.2.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 1.4 其它
• 2 方法
• 2.1 样品的采集
• 2.2 样品的处理
• 2.2.1 蚊子样品的处理
• 2.2.2 流产死胎的处理
• 2.3 病毒的分离与培养
• 2.3.1 乳鼠脑内接种
• 2.3.2 细胞培养
• 2.4 病毒的初步纯化
• 2.5 病毒的鉴定
• 2.5.1 电镜形态观察
• 2.5.2 琼扩实验
• 2.5.3 病毒微量中和试验（固定病毒稀释血清法）
• 2.5.4 间接免疫荧光实验（IFA）
• 2.5.5 间接ELISA实验
• 2.5.6 病毒株的PCR鉴定
• 3、实验结果
• 3.1 病毒分离结果
• 3.1.1 乳鼠分离结果
• 3.1.2 细胞培养结果
• 3.2 病毒鉴定结果
• 3.2.1 电镜超微结构检查结果
• 3.2.2 琼扩实验结果
• 3.2.3 中和实验结果
• 3.2.4 间接免疫荧光实验结果
• 3.2.5 间接ELISA实验结果
• 3.5.6 RT-PCR鉴定结果
• 4. 讨论
• 5. 小结
• 第二章 乙型脑炎病毒生物学特性研究
• 1. 材料
• 1.1 病毒、细胞、实验动物
• 1.2 细胞培养基
• 1.3 主要仪器设备
• 2. 方法
• 2.1 细胞培养特性
• 2.2 血凝试验
• 2.3 病毒滴度测定
• 2.3.1 病毒细胞半数感染量（TCID50）的测定
• 2.3.2 小鼠LD50测定
• 2.4 病理切片观察
• 2.5 核酸类型测定及理化性质测定
• 2.5.1 病毒的核酸类型鉴定
• 2.5.2 乙醚敏感试验
• 2.5.3 氯仿敏感试验
• 2.5.4 耐酸性试验
• 2.5.5 胰蛋白酶敏感试验
• 2.5.6 耐热性试验
• 3. 结果
• 3.1 BHK21细胞培养特性
• 3.3 TCID50测定
• 3.4 小鼠LD50测定
• 3.4.1 9-11g未成年小鼠LD50测定
• 3.4.2 14-16g成年鼠LD50
• 3.5 动物实验病理切片观察
• 3.6 核酸类型及理化特性检测结果
• 4. 讨论
• 4.1 病毒特性
• 4.2 基因型与毒力关系
• 4.3 小鼠感染模型
• 4.3.1 小鼠致病性
• 4.3.2 病理变化
• 5. 小结
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录