CpG重组质粒的体外筛选及其在猪体内的安全性研究

论文摘要

本研究用已构建的pcDNAKCpG-1、2、3、4,并按每孔1.25μg、2.5μg、5.0μg、10.0μg的剂量刺激用淋巴细胞分离液分离的SPF猪外周血单个核细胞（PBMC）,进行淋巴细胞体外转化试验,用MTT比色法测定其转化效果,以比较不同质粒及其浓度对猪外周血淋巴细胞的刺激效果。结果表明:四种质粒对猪外周血单个核细胞均有不同程度的刺激效果,其中10.0μg剂量的pcDNAKCpG-4对猪淋巴细胞的刺激指数达到了6.3;pcDNAKCpG-2在较低剂量下就具有较高的刺激指数,对猪具有最佳的免疫刺激活性。 用对猪具有最佳免疫刺激活性的重组质粒pcDNKCpG-2,按500μg/头的剂量肌肉接种于试验猪,分别于注射后4h、4d、8d、15d、30d屠宰并采集、提取主要组织器官的DNA,然后根据重组质粒序列设计引物并进行PCR检测,以确定重组质粒在猪体内的分布和停留时间。结果表明:在注射后4h,可在猪注射部位肌肉检测到重组质粒pcDNAKCpG-2;在注射后4d,可在1头猪的血液和注射部位肌肉检测到重组质粒pcDNAKCpG-2;在注射后8d,任何组织都检测不到重组质粒的存在。 在上述研究的基础上,进一步对PCR检测阳性的猪主要组织gDNA和注射后30d的猪主要组织gDNA,以地高辛标记的CpG序列为探针,进行Southern blotting试验,检测是否有CpG序列与猪gDNA发生整合。结果显示:CpG序列与猪gDNA未发生整合。 总之,重组质粒pcDNAKCpG-2对猪具有最佳免疫刺激效果,作为免疫佐剂在猪体内的停留时间少于8d,且不会与猪基因组发生整合。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 目录
• 第一章 绪论
• 1 CpG的发现
• 2 CpG基序的结构特点及种属特异性
• 2.1 CpG基序的结构特点
• 2.2 CpG基序的种属特异性
• 3 CpG ODN的免疫刺激效应
• 4 CpG DNA的应用前景
• 5 CpG DNA佐剂的安全性评价
• 5.1 质粒DNA的安全性评价
• 5.2 质粒DNA的检测
• 6 本研究的目的和意义
• 第二章 对猪具有最佳免疫刺激活性的CpG重组质粒的筛选
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 重组质粒对猪淋巴细胞的刺激效果
• 3 讨论
• 第三章 重组质粒PCDNAKCPG-2在猪体内的停留时间试验
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 gDNA提取结果
• 2.2 PCR敏感度
• 2.3 质粒PCDNAKCPG-2在猪体内存留时间和分布
• 3 讨论
• 第四章 重组质粒PCDNAKCPG-2与猪基因组DNA整合状况研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 重组质粒的酶切结果
• 2.2 探针标记用DNA片段制备的结果
• 2.3 探针敏感度
• 2.4 重组质粒PCDNAKCPG-2与猪GDNA整合检测结果
• 3 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历