家兔骨形态发生蛋白-7（BMP-7）cDNA的克隆与表达

论文摘要

本研究主要目的是对家兔BMP-7基因的结构特征进行分析,为研究BMP-7基因在胚胎的发生和发育以及其它生殖生理过程的作用提供参考。主要得到以下一些结论:1)结合数据库已有的兔BMF-7基因部分编码序列,采用RT-PCR与RACE技术,从家兔肾脏组织中克隆到一条长1654bp包含了家兔BMP-7基因大部分cDNA的序列（GenBank:EU004072;EF583950;EU599645）,该基因序列含有信号肽段除外的其它区段（缺少第1位氨基酸的前肽和成熟蛋白）:446 bp长的3’非翻译序列（3’UTR）。其中,417bp,编码139个氨基酸残基的成熟肽CDS,其编码蛋白的理论分子量为15.6 kDa,理论等电点（PI）为8.04。该序列将已有的序列向5’和3’端分别延伸了395 bp和640 bp。2)序列对比表明,克隆的家兔BMP-7基因CDS部分（1205 bp）人、小鼠的对应序列的相似性分别为91.89%、89.32%,预测的氨基酸序列相似性分别为96.51%、96.01%。家兔BMP-7 3’UTR长446 bp,具有2个转录终止信号（AAUAAA）位点和poly（A）11,与人、小鼠、牛、猪BMP-7 mRNA 3’UTR的相似性分别50.30%、41.45%、47.84%和57.91%。推测的家兔BMP-7成熟蛋白有BMPs特有的7个位置固定的半胱氨酸残基和TGF-β家族指纹。因此,我们成功地克隆了BMP-7的大部分cDNA序列。另外,家兔BMP-7 3’UTR区转录终止信号的可选择性可能与基因转录后调控有关。3)对家兔BMP-7基因的体内表达情况进行了分析,发现BMP-7基因在2月龄家兔体内许多组织中都表达。其中,BMP-7基因在心、脾组织以低丰度表达,在肺、脊髓、十二指肠以中等丰度表达,在肝、肾、脑中以高丰度表达。4)将家兔BMV7基因的成熟肽段克隆入pET32a原核表达载体后,成功构建了家兔BMp-7基因的原核表达系统pET32a-BMP-7/BL21（DE3）和pET32a-BMP-7/BL21（DE3）PlysS。表达的融合蛋白质大小约为33.2 kDa,包括了15.6 kDa的家兔BMP-7目的蛋白和17.6kDa的pET32a表达载体蛋白。根据目的蛋白的表达量,优化了IPTG诱导pET32a-BMP-7/BL21（DE3）表达的适宜条件。低温（20℃～30℃）条件下,IPTG诱导pET32a-BMP-7/BL21（DE3）表达时,IPTG浓度不可过低,而为减少包涵体的形成,以26℃～30℃,0.1 mM IPTG,5 h诱导其表达;20℃～25℃,0.2 mM IPTG,8 h诱导其表达较合适。

论文目录

• 摘要
• SUMMARY
• 缩略词表
• 1 文献综述
• 1.1 TGF-B超家族
• 1.2 骨形态发生蛋白（BMPs）的研究进展
• 1.2.1 BMPs的发现简史
• 1.2.2 BMPs的组织分布
• 1.2.3 BMP的染色体定位
• 1.2.4 BMP的结构
• 1.3 骨形态发生蛋白-7（BMP-7）的研究进展
• 1.3.1 BMP-7的分子结构特点
• 1.3.2 BMP-7的受体及信号传递
• 1.3.3 BMP-7的调节
• 1.3.4 生物学作用
• 1.3.4.1 BMP-7在胚胎发育过程中的作用
• 1.3.4.2 BMP-7在骨骼系统的作用
• 1.3.4.3 BMP-7在神经系统的作用
• 1.3.4.4 BMP-7对肾脏的保护作用
• 1.4 BMP-7的前景
• 1.5 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 质粒和菌种
• 2.1.2 实验材料
• 2.1.3 主要试剂及来源
• 2.1.4 主要仪器、设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 常用培养基、缓冲液与试剂的配制
• 2.2.1.1 培养基
• 2.2.1.2 常用贮液与溶液
• 2.2.1.3 染料、电泳缓冲液、凝胶加样液
• 2.2.2 总RNA提取
• 2.2.2.1 试剂盒提取总RNA
• 2.2.2.2 Animal RNAout提取总RNA
• 2.2.2.3 RNA质量的检测
• 2.2.3 引物设计
• 2.2.4 兔部分cDNA的合成
• 2.2.4.1 RT-PCR引物设计
• 2.2.4.2 反转录反应
• 2.2.4.3 PCR反应
• 2.2.5 3′RACE技术
• 2.2.5.1 3′RACE原理
• 2.2.5.2 3′RACE引物的设计
• 2.2.5.3 3′RACE反应
• 2.2.5.4 套式PCR反应
• 2.2.6 PCR产物的纯化、克隆、鉴定和测序
• 2.2.6.1 PCR产物的回收纯化
• 2.2.6.2 PCR产物的克隆
• 2.2.6.3 重组质粒DNA测序
• 2.2.7 DNA序列相似性检索鉴定及其分析
• 2.2.7.1 DNA序列相似性检索鉴定
• 2.2.7.2 家兔与其它哺乳动物BMP-7 3'UTR比较生物信息学分析
• 2.2.8 家兔BMP-7基因的组织表达谱初步研究
• 2.2.9 家兔BMP-7基因成熟肽的原核表达初步研究
• 2.2.9.1 目的片段的制备
• 2.2.9.2 构建pET32a-BMP-7重组质粒
• 2.2.9.3 序列测序
• 2.2.9.4 基因工程菌的构建
• 2.2.9.5 重组原核工程菌pET32a-BMP-7/BL21（DE3）的优化表达
• 2.2.9.6 SDS-PAGE电泳检测
• 3 结果与分析
• 3.1 总RNA的提取及检测
• 3.2 家兔BMP-7基因的克隆及分析
• 3.2.1 家兔BMP-7基因部分编码区的克隆
• 3.2.1.1 目的基因的扩增
• 3.2.1.2 重组质粒鉴定
• 3.2.2 家兔BMP-7基因3'端非翻译序列的克隆
• 3.2.2.1 3'RACE扩增产物
• 3.2.2.2 目的DNA的回收
• 3.2.2.3 重组质粒及质粒的PCR和酶切鉴定
• 3.2.3 家兔BMP-7基因cDNA序列测定与生物信息学分析
• 3.2.3.1 克隆片断序列测定
• 3.2.3.2 家兔BMP-7基因相似性及结构分析
• 3.2.3.3 家兔与其它哺乳动物BMP-7 3'UTR序列对比分析
• 3.2.3.4 人BMP-7基因转录本末端分析
• 3.3 组织表达
• 3.4 原核表达
• 3.4.1 目的片段的扩增及回收
• 3.4.2 重组质粒及其重组质粒PCR鉴定
• 3.4.3 测序结果
• 3.4.3.1 两克隆碱基测序结果比较分析
• 3.4.3.2 两克隆相对应的氨基酸分析
• 3.4.3.3 家兔BMP-7基因成熟肽中稀有碱基分析
• 3.4.4 工程菌pET32a-BMP-7/BL21（DE3）的构建
• 3.4.5 重组原核工程菌pET32a-BMP-7/BL21（DE3）的优化表达
• 3.4.5.1 37℃诱导pET32a-BMP-7/BL21（DE3）表达
• 3.4.5.2 低温诱导pET32a-BMP-7/BL21（DE3）表达
• 3.4.6 重组原核工程菌pET32a-BMP-7/BL21（DE3）（20号质粒与7号质粒）的诱导表达对比
• 3.4.7 重组原核工程菌pET32a-BMP-7/BL21（DE3）plysS的诱导表达
• 4 讨论
• 4.1 总RNA提取
• 4.2 EST的开发
• 4.3 BMP-7基因克隆与分析
• 4.4 3'RACE
• 4.5 3'UTR与基因表达调节
• 4.6 BMP-7蛋白性质和功能位点的预测
• 4.7 家兔BMP-7的组织表达谱分析
• 4.8 BMP-7基因的原核表达分析
• 5 小结
• 附录A 家兔BMP-7基因cDNA测序结果
• 附录B 家兔BMP-7基因GENBANK登录序列
• 致谢
• 参考文献
• 个人简介
• 导师简介