利用重组S.cerevisiae生产腺苷甲硫氨酸及发酵条件优化研究

论文摘要

S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine, SAM）是广泛存在于各种生物体内的一种生理活性物质,在体内起着转甲基、转硫基、转氨丙基的作用,具有重要的药用和保健价值。在生物体内,S-腺苷甲硫氨酸（SAM）是由SAM合成酶催化甲硫氨酸与ATP生物合成的。本论文通过PCR技术,从酿酒酵母TCCC 31012扩增目的基因sam2,构建表达载体pACT2-sam2,以醋酸锂转化法转化酿酒酵母YS58,构建组成型表达S-腺苷蛋氨酸合成酶-2（SAMS2）的酿酒酵母（S.cerevisiae）工程菌株。通过SDS-PAGE电泳对酿酒酵母阳性转化子胞内的蛋白进行分析,表达蛋白的分子质量（43kDa）与文献报道的酿酒酵母SAMS2的相对分子质量大小相符,因此,认为酿酒酵母SAM合成酶2基因（sam2）在酿酒酵母YS58中得到了表达。筛选了一株高效表达目的蛋白的工程菌株YS58-5。对工程菌株YS58-5的发酵培养基及培养条件进行了优化、确定了培养的初始pH、培养温度、装液量、接种量等工艺参数。优化条件：碳源以葡萄糖最好,氮源选择了（NH4）2SO4,同时发现随着细胞生长,细胞内同时表达外源SAMS2,累积SAM。并确定发酵培养基组分为（g／L）：酵母提取物8、葡萄糖50、（NH4）2SO45、K2HPO44、KH2PO42、MnSO40.01、MgSO4·7H2O 0.2、ZnCl20.01、L-甲硫氨酸5、硫酸腺嘌呤0.04。初始pH值5.0、培养温度30℃、装液量10%、接种量7%的摇瓶发酵条件。采用优化条件,重组工程菌株YS58-5发酵3d的SAM产量为3.02g／L发酵液。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 S-腺苷甲硫氨酸概况
• 1.1.1 S-腺苷甲硫氨酸的结构
• 1.1.2 S-腺苷甲硫氨酸的基本性质
• 1.2 S-腺苷甲硫氨酸在体内的作用
• 1.2.1 转甲基作用
• 1.2.2 转氨丙基作用
• 1.2.3 转硫作用
• 1.2.4 S-腺苷甲硫氨酸的生物学作用
• 1.3 S-腺苷甲硫氨酸的制备方法
• 1.3.1 化学合成法
• 1.3.2 酶促转化法
• 1.3.3 微生物合成法
• 1.4 S-腺苷甲硫氨酸生产的研究历史及现状
• 1.4.1 S-腺苷甲硫氨酸稳定化研究
• 1.4.2 S-腺苷甲硫氨酸稳定性盐的开发
• 1.4.3 S-腺苷甲硫氨酸的提取、分离纯化及测定
• 1.4.4 S-腺苷甲硫氨酸的应用
• 1.5 S-腺苷甲硫氨酸合成酶简介
• 1.5.1 S-腺苷甲硫氨酸合成酶的基本性质
• 1.5.2 S-腺苷甲硫氨酸合成酶催化的化学反应
• 1.5.3 S-腺苷甲硫氨酸合成酶的基本结构
• 1.5.4 S-腺苷甲硫氨酸合成酶及其编码基因的概述
• 1.6 SAM合成酶基因工程菌的构建和转化研究
• 1.6.1 SAM合成酶基因工程菌的构建
• 1.6.2 转化反应及产物抑制
• 1.7 论文的立题背景及研究内容
• 1.7.1 立题背景
• 1.7.2 研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 质粒及菌株
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 工具酶及标准蛋白
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.1.5 相关溶液
• 2.1.6 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌体培养及保藏
• 2.2.2 摇瓶发酵
• 2.2.3 酿酒酵母基因组ONA的提取方法
• 2.2.4 大肠杆菌中质粒的提取
• 2.2.5 质粒DNA对大肠杆菌的转化
• 2.2.6 聚合酶链式反应（PCR）
• 2.2.7 DNA片段的回收
• 2.2.8 DNA连接
• 2.2.9 基因测序
• 2.2.10 酿酒酵母醋酸锂转化
• 2.2.11 酿酒酵母电转化方法
• 2.2.12 酿酒酵母菌落PCR方法
• 2.2.13 酿酒酵母DNA的快速分离
• 2.2.14 琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.15 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2.16 重组质粒的稳定性分析
• 2.2.17 SAM含量的测定-高效液相色谱法
• 2.2.18 SAM合成酶活力的测定
• 2.2.19 细胞干重的测定
• 3 结果与讨论
• 3.1 SAM合成酶基因（sam2）的克隆
• 3.1.1 酿酒酵母基因组DNA的提取
• 3.1.2 PCR扩增目的基因
• 3.2 重组质粒pUC19-sam2的构建及转化
• 3.2.1 pUC19质粒图谱
• 3.2.2 重组质粒pUC19-sam2的构建
• 3.2.3 克隆与转化
• 3.2.4 阳性转化子的检出与鉴定
• 3.3 表达载体pACT2-sam2的构建及转化
• 3.3.1 表达载体pACT2的特性
• 3.3.2 表达载体pACT2-sam2的构建
• 3.3.3 重组表达载体pACT2-sam2转化酿酒酵母YS58
• 3.3.4 阳性转化子的检出与鉴定
• 3.4 转化子SAM合成酶活力及胞内SAM含量的测定
• 3.4.1 HPLC法
• 3.4.2 转化子SAM合成酶活力及胞内SAM含量的测定
• 3.4.3 验证外源SAMS2基因表达提高了重组菌SAMS活力
• 3.4.4 重组质粒稳定性分析
• 3.5 工程菌YS58-5发酵条件优化
• 3.5.1 发酵培养基的优化
• 3.5.2 摇瓶发酵条件的优化
• 3.5.3 最适条件下的发酵过程曲线
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 8 致谢