核因子Y介导成骨相关细胞中FGFR2启动子的基础活性

论文摘要

目的:成纤维生长因子（FGFR2）在骨的发育过程中具有十分重要的调控作用。但目前对于FGFR-2表达的调控机制的研究仍然不是很清楚。因此,本论文主要进行对成骨相关细胞中FGFR-2基因表达的转录调控机制及染色质开放状态进行研究,为进一步探索FGF通路及其对骨发生的调控机制打下基础。方法:首先采用DNaseⅠ超敏感和CHART-PCR实验确定FGFR2基因转录活跃区域;然后在此基础上通过双荧光报告系统搜寻FGFR2的上游启动子元件并进行精确定位;接着,再通过EMSA,ChIP,SiRNA干扰等实验确定关键转录因子;最后再次通过RNAi实验进行关键转录因子对FGFR2基因转录调控机制的研究。结果:DNaseⅠ超敏感和CHART-PCR将潜在启动子范围缩短为-143/+45之间;双荧光报告系统分析筛出FGFR-2启动子最主要的活性范围是-86/-48,并经软件预测该区域含有CCAAT box;EMSA实验证实在CCAAT box可与NF-Y转录因子特异结合;染色质免疫共沉淀实验验证了NF-Y与CCAAT box在生理状态下的原位结合;最后,SiRNA干扰内源NF-Y后,内源FGFR2表达被抑制,染色质可及性以及组蛋白H3的乙酰化都有所改变。结论:通过以上实验结果显示,NF-Y转录因子通过与FGFR2启动子上CCAAT序列结合来调控FGFR2基因的转录,同时又证明NF-Y还与染色质组蛋白H3的乙酰化有关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 一 前言
• 1 文献综述
• 1.1 成纤维生长因子及其受体
• 1.2 FGF/FGFR2信号途径与骨的发育
• 1.3 FGFR2调控机制的研究和进展
• 2 本论文的研究内容及意义
• 2.1 研究意义
• 2.2 研究内容
• 3 研究思路
• 二 实验仪器与材料
• 1 材料
• 1.1 细胞株、细菌与质粒
• 1.2 主要试剂与试剂盒
• 1.3 常用试剂及配方
• 2 仪器与设备
• 三 实验方法
• 1 DnaseⅠ超敏感实验
• 1.1 细胞核抽提
• 1.2 DnaseⅠ消化细胞核
• 1.3 DnaseⅠ消化基因组抽提
• 1.4 探针标记
• 2 Southern Blot
• 3 CHART-PCR
• 4 凝胶迁移实验（EMSA）
• 4.1 核蛋白的提取
• 4.2 探针的标记
• 4.3 探针标记率的测定
• 4.4 反应与电泳
• 5 FGFR2启动子缺失突变的Luciferase报告载体构建
• 5.1 实验设计
• 5.2 基因组DNA的制备
• 5.3 PCR扩增
• 5.4 切胶回收纯化PCR或酶切产物
• 5.5 PCR产物的酶切
• 5.6 连接反应
• 5.7 转导大肠杆菌
• 5.8 重组子的快速鉴定
• 5.9 质粒的抽提
• 5.10 酶切鉴定
• 6 RT-PCR
• 6.1 检测引物设计
• 6.2 总RNA抽提
• 6.3 总RNA纯度和完整性检测
• 6.4 逆转录
• 6.5 PCR
• 7 Erase-a-base方法构建缺失突变载体
• 8 核心启动子元件的活性检测
• 8.1 转染用质粒的制备
• 8.2 质粒转染细胞
• 8.3 Lucifersae检测
• 9 siRNA分子转染成骨相关细胞
• 10 染色质免疫共沉淀
• 11 启动子点突变
• 11.1 PCR技术进行启动子点突变
• 11.2 Blunting Kination反应
• 11.3 Ligation反应
• 四 结果与分析
• 1 FGFR2在成骨相关细胞中的表达
• 2 FGFR2基因与启动子结构的分析
• 3 FGFR2基因转录活跃区域的确定
• 3.1 DNaseⅠ超敏感实验对FGFR2基因转录活跃区初步定位
• 3.2 CHART-PCR实验进一步缩小FGFR2基因转录活跃范围
• 4 FGFR2基因上游启动子元件的搜寻
• 5 转录因子NF-Y与FGFR2上游启动子元件特异结合
• 5.1 上游启动子元件片段与NF-Y的结合
• 5.2 转录因子NF-Y与FGFR2启动子的原位结合
• 5.3 转录因子NF-Y决定FGFR2启动子基础活性
• 6 转录因子NF-Y调控FGFR2基因转录的机制探索
• 五 讨论
• 参考文献
• 在学期间发表论文清单
• 致谢