杆状病毒携带的基因拷贝数与重组蛋白表达效率关系研究

论文摘要

杆状病毒-昆虫细胞多基因表达系统因为具有能容纳大片段外源基因插入、表达量高、能同时表达多个基因、安全等特点,成为研究多蛋白复合物的最佳系统。MultiBac系统是目前在杆状病毒多基因表达系统中,实现真核多蛋白复合物或者单个基因多拷贝在昆虫细胞中表达的有力工具。该系统由2个供体载体pFBDM和pUCDM和改造过的受体Bacmid组成。其中pFBDM载体来源于pFastdual,含有Tn7转座序列和GM抗性基因,含有双启动子（p10和多角体polh启动子）、2个MCS、2个polyA加尾信号序列（SV40, HSVtk）。pUCDM含R6kγ条件型复制子和CM抗性基因,还有一个loxp位点,受体Bacmid保留了原有的Tn7转座受体位点,又引入了1个loxp位点。转移载体pFBDM携带外源基因Tn7转座进MultiBacmid,转移载体pUCDM携带外源基因经Cre/Loxp位点特异性重组进MultiBacmid,可同时实现多个基因表达。理论认为,整合的拷贝数与基因的表达量会遵循剂量效应,即随着拷贝数的增加,蛋白表达量会逐渐提高;也有研究认为基因拷贝数和蛋白表达量没有直接线性关系,但是在杆状病毒表达系统中是否遵循基因剂量效应,目前为止尚未见相关报道。本实验以gfp为目的基因,来探究基因拷贝数对杆状病毒在昆虫细胞中蛋白表达量的影响。gfp基因是一个广泛使用的报告基因,它可以在昆虫细胞中正常表达,经蓝光（488nm）激发,被激发出绿色荧光（512nm）,检测方便。利用MultiBac系统构建了七种含有不同拷贝gfp基因的重组病毒rAcMultiBac-p10-gfp、rAcMultiBac-ph-gfp、rAcMultiBac-p10-ph-2gfp、rAcMultiBac-p10-2ph-3gfp、rAcMultiBac-2p10-ph-3gfp、rAcMultiBac-2p10-2ph-4gfp和rAcMultiBac-3p10-3ph-6gfp。用自制的EGFP多克隆兔抗体进行Western Blot检测,并通过激光共聚焦和荧光分光光度计首先对两个极晚期启动子p10和ph的活性进行了比较,得出ph控制表达的EGFP荧光蛋白表达量要比p10控制的的表达量高1倍。然后对含不同基因gfp拷贝数的重组病毒（一到四拷贝）在昆虫细胞中的表达情况进行了定性和定量分析,发现蛋白表达量随着基因拷贝数增加而增加,但不是呈线性比例倍数增长,当拷贝数由1增加3时,荧光蛋白表达量提高了近2倍,从0.2%提高到了0.41%;拷贝数为4时,荧光蛋白表达量比单拷贝提高了20倍;对2gfp、4gfp和6gfp的重组病毒蛋白表达情况进行了比较,发现随着基因gfp拷贝数以2倍形式增加时,四拷贝荧光蛋白表达量最高,到六拷贝时有所下降。因此在杆状病毒表达系统中,通过提高基因拷贝数能显著提高目标蛋白表达量,而且只需要构建携带四拷贝外源基因就可以获得最佳表达效果,为杆状病毒多基因表达系统高效表达外源基因提供了理论基础和技术路线。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表（Abbreviation）
• 1 前言
• 1.1 多基因表达系统的研究意义
• 1.2 杆状病毒多基因表达系统研究概况
• 1.3 杆状病毒表达载体系统
• 1.3.1 杆状病毒表达载体系统的优点
• 1.3.2 杆状病毒表达载体系统的不足
• 1.3.3 杆状病毒表达载体的构建策略
• 1.3.4 杆状病毒表达载体系统的应用
• 1.4 立题依据和研究意义
• 2 实验材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 质粒、菌株、酶、试剂
• 2.1.2 培养细胞以及免疫动物
• 2.1.3 引物
• 2.1.4 主要仪器
• 2.1.5 溶液的配制
• 2.2 分子生物学试验方法[88]
• 2.2.1 质粒的提取
• 2.2.2 限制性酶消化
• 2.2.3 PCR 反应常规体系
• 2.2.4 DNA 片段回收（参照AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒）
• 2.2.5 DNA 片段和载体的连接
• 2.2.6 感受态细胞的制备
• 2.2.7 质粒DNA 的转化
• 2.2.8 菌种的保存
• 2.3 Bac-Bac 技术
• 2.3.1 转座
• 2.3.2 重组Bacmid DNA 的提取
• 2.4 昆虫细胞培养实验技术
• 2.4.1 培养细胞的玻璃器皿的清洗与消毒
• 2.4.2 细胞培养基的配制（以Grace 为例）
• 2.4.3 细胞传代培养
• 2.4.4 细胞计数
• 2.4.5 细胞转染（脂质体转染）
• 2.4.6 病毒的增殖
• 2.4.7 病毒的滴度测定[89]
• 2.5 蛋白质分析技术
• 2.5.1 总蛋白含量的测定和标准曲线的绘制
• 2.5.2 SDS－PAGE 不连续垂直板电泳
• 2.5.3 多克隆EGFP 兔抗体的制备
• 2.5.4 荧光蛋白标准曲线的绘制
• 2.5.5 Western Blot（免疫印记）
• 3 结果和分析
• 3.1 基因克隆
• 3.1.1 HgS 和SgH 目的基因的扩增
• 3.1.2 HgS 和SgH 基因的T 载体克隆及方向的鉴定
• 3.2 转移载体的构建
• 3.2.1 单拷贝转移载体的构建
• 3.2.2 多拷贝转移载体的构建
• 3.3 含不同gfp 拷贝数的重组杆状病毒穿梭载体的构建
• 3.3.1 Tn7 重组获得三个重组杆状病毒穿梭载体pAcMultiBac-p10-gfp 、pAcMultiBac-ph-gfp 和pAcMultiBac-2p10-2ph-49fp
• 3.3.2 Loxp 位点特异性重组获重组杆状病毒穿梭载体pAcMultiBac-p10-ph-29fp
• 3.3.3 Tn7 和 Loxp 位点重组获得重组杆状病毒病毒穿梭载体pAcMultiBac-p10-2ph-39fp 和pAcMultiBac-2p10-ph-39fpp，AcMultiBac-3p10-3ph-6
• 3.4 多克隆EGFP 兔抗体的制备
• 3.4.1 egfp 目的基因的扩增
• 3.4.2 pet32a-egfp 载体的构建及验证
• 3.4.3 目的蛋白EGFP 的表达
• 3.4.4 透析袋电洗脱回收目的蛋白
• 3.4.5 Western Blot 检测EGFP 兔抗体的表达
• 3.5 重组杆状病毒介导的不同拷贝数目的GFP 表达与检测
• 3.5.1 细胞转染及病毒扩增
• 3.5.2 病毒滴度测定结果
• 3.5.3 总蛋白标准曲线和荧光蛋白标准曲线的绘制
• 3.5.4 Western Blot 结果
• 3.5.5 相同拷贝数不同启动子控制下GFP 的表达水平的比较
• 3.5.6 不同拷贝数gfp 重组病毒的表达水平的比较
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文目录