葡萄5个重要氮代谢相关基因的克隆与表达分析

论文摘要

氮肥的吸收和同化是植物发育和成长的重要过程。本研究利用VitisEST数据库中EST序列片段结合RT-PCR方法克隆了与氮同化相关的5个主要基因有硝酸盐还原酶（NR）,亚硝酸还原酶（NiR）,谷氨酰胺合成酶（GS）,谷氨酸脱氢酶（GDH）和天冬酰胺合成酶（AS）的编码基因,进行了亚细胞定位分析,并运用半定量RT-PCR和荧光定量PCR法研究了上述各基因在葡萄叶面喷施尿素后不同组织与时间段的表达情况。通过叶面尿素不同施用量和土壤施尿素处理,研究不同处理对葡萄品质指标的影响,旨在为葡萄生产栽培及科学施肥提供理论依据,对界定合理的施肥浓度和指导生产具有深远意义。生物化学与分子生物学的理论和技术已被广泛用于疾病的诊断、治疗和预防,现代生物学技术的出现为人们利用基因信息指导施肥提供了可能,根据实际生产与研究需要,本实验分离和克隆了氮代谢循环途径中上述5个关键酶调控基因（GS, GOG AT, GDH, AS, NR和NiR）的编码序列,利用基因的表达信息对施尿素效果的有无进行了检测,主要研究结果如下：1.本研究利用VitisEST数据库中EST序列片段结合RT-PCR方法克隆了与氮代谢相关的5个主要基因硝酸盐还原酶（NR）,亚硝酸还原酶（NiR）,谷氨酰胺合成酶（GS）,谷氨酸脱氢酶（GDH）和天冬酰胺合成酶（AS）的编码基因（登录号见表2-1）,为进一步认识所克隆的GDH、NiR、NR、GS、AS基因表达的蛋白在细胞中发挥功能的具体部位,本研究对其进行了亚细胞定位分析,结果表明GDH-GFP定位于线粒体,NR-GFP定位于细胞膜和细胞质,AS-GFP定位于细胞质,而NiR-GFP和GS-GFP在细胞内未产生绿色荧光。2.运用半定量RT-PCR和荧光定量PCR法研究了上述各基因在葡萄叶面喷施尿素后不同组织与发育期的表达情况。研究结果表明,5个基因在幼叶中的表达明显高于老叶,其中以0.3%和0.5%浓度尿素处理的效果显著；5个基因的表达水平在喷施尿素后6h时直至48h时均高于对照。NR在各个阶段的表达水平都高于NiR, GS在各个阶段的表达水平也高于AS,基本上NiR、AS表达量的变化趋势分别与NiR、GS表达量相一致。在葡萄叶片喷施尿素后6h时GS基因的表达量比其它基因上升明显,而相比其它基因NR基因在葡萄叶片喷施尿素后直至48h一直保持着比较高的表达水平,因此其两者可分别作为葡萄叶片喷施尿素前期和中后期的氮代谢信号途径的标记基因。3.本试验利用半定量RT-PCR和荧光定量PCR技术对5个‘藤稔’葡萄氮代谢基因在施尿素后不同时间段下的表达进行分析。所研究的基因包括：Vitis vinifera GHD（VvGHD）、Vitis vinifera NiR（VvNiR）、Vitis vinifera NR（VvNR）、Vitis vinifera GS （VvGS）和Vitis vinifera AS（VvAS）.结果表明,半定量RT-PCR与荧光定量PCR两者的结果存在高度一致性,5个基因在叶面喷施尿素后不同时间段的表达量存在显著差异性,整体呈先升高后降低的趋势；VvGDH最高表达水平发生在72h,VvNR和VvNiR最高表达水平发生在24h,VvGS最高表达水平发生在6h, VvAS最高表达水平发生在2h。土壤施肥后叶中5个基因对尿素的响应时间比根中要延后,而响应强度明显高于根中对应基因。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词（Abbreviation）
• 引言
• 第一章 文献综述
• 第二章 葡萄5个重要氮代谢相关基因的克隆与亚细胞定位分析
• 摘要
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 质粒、菌株等分子生物学试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 葡萄总RNA的提取
• 1.2.2 总RNA中DNA的消化
• 1.2.3 cDNA第一链的合成
• 1.2.4 葡萄5个氮代谢相关基因ORF区的扩增
• 1.2.5 葡萄5个氮代谢相关基因cDNA的3’RACE扩增
• 1.2.6 葡萄氮代谢5个相关基因的亚细胞定位分析
• 1.2.7 基因枪法转化洋葱表皮细胞
• 2 结果与分析
• 2.1 葡萄各组织总RNA提取纯度检测
• 2.2 葡萄5个氮代谢相关基因ORF区的克隆结果
• 2.3 葡萄5个氮代谢相关基因的3’RACE克隆结果
• 2.4 葡萄氮代谢5个相关基因的亚细胞定位分析
• 3 讨论
• 第三章 利用基因表达检测葡萄叶面喷施尿素的初步研究
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 生化试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 不同处理对葡萄品质指标的影响
• 1.2.2 RNA的提取与纯化
• 1.2.3 cDNA合成
• 1.2.4 基因序列与引物合成
• 1.2.5 半定量RT-PCR
• 1.2.6 荧光定量PCR
• 2 结果与分析
• 2.1 叶面喷施不同浓度尿素对葡萄单粒重、单穗重、果实大小及叶片生长情况的影响
• 2.2 葡萄各组织总RNA提取纯度检测
• 2.3 相关基因的时空表达分析
• 2.3.1 基因特异引物的PCR验证
• 2.3.2 叶面喷施不同浓度尿素对葡萄硝酸还原酶基因表达的影响
• 2.3.3 叶面喷施不同浓度尿素对葡萄亚硝酸还原酶基因表达的影响
• 2.3.4 叶面喷施不同浓度尿素对葡萄谷氨酰胺合成酶基因表达的影响
• 2.3.5 叶面喷施不同浓度尿素对葡萄天冬酰胺合成酶基因表达的影响
• 2.3.6 叶面喷施不同浓度尿素对葡萄谷氨酸脱氢酶基因表达的影响
• 3 讨论
• 第四章 尿素施肥对葡萄5个氮代谢相关基因表达的影响
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 化学肥料
• 1.1.3 生化试剂
• 1.1.4 引物设计
• 1.2 方法
• 1.2.1 施肥试验设计
• 1.2.2 葡萄样品的采集
• 1.2.3 RNA的提取与纯化
• 1.2.4 cDNA合成
• 1.2.5 基因特异引物的PCR验证
• 1.2.6 半定量RT-PCR
• 1.2.7 荧光定量PCR
• 2 结果与分析
• 2.1 不同处理对葡萄品质指标的影响
• 2.2 葡萄各组织总RNA提取纯度检测
• 2.3 基因特异引物的PCR验证
• 2.4 基因的表达
• 2.4.1 叶面喷施尿素对葡萄叶中5个氮代谢基因在不同时间段表达的影响
• 2.4.2 土壤施尿素对葡萄叶片和根中5个氮代谢基因在不同时间段表达的影响
• 3 讨论
• 全文总结
• 创新点
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士期间论文发表与投稿情况
• 致谢