转Nurr1基因联合全反式维甲酸及银杏提取物诱导分化的神经干细胞治疗帕金森病大鼠模型

论文摘要

研究背景帕金森病（Parkinson’s disease,PD）中老年人群中一种常见的中枢神经系统变性疾病,其基本病理改变是黑质-纹状体多巴胺系统进行性变性,临床以震颤、强直、运动迟缓及姿势平衡障碍为主要特征。目前该病的临床治疗主要依靠药物和外科手术,两者均属对症性,因而均不能阻止病情的进行性发展,很多中晚期病人的症状常不能得到有效控制,致残率极高。细胞移植治疗是比较有前景的治疗手段。神经干细胞是具有多向分化潜能的神经前体细胞,在不同的诱导条件下可分化为不同类型的神经元或胶质细胞,被认为在帕金森病的细胞及基因治疗方面具有一定的应用潜力。孤儿核受体（nuclear related regulator-1,Nurr1）是类固醇/甲状腺激素核受体超家族成员的转录因子,能调节多巴胺能神经元的发育并维持其表型。我们前期工作结果表明Nurr1基因修饰和全反式维甲酸及银杏提取物诱导可以促进NSCs向多巴胺能神经元分化,但这种体外诱导分化的神经细胞对PD是否有治疗效应还没有得到证实。目的:探讨Nurr1基因修饰联合全反式维甲酸（ATRA）及银杏提取物（Egb）诱导分化的神经干细胞（NSCs）移植治疗帕金森病动物模型的疗效及作用机制。方法:体外分离、纯化和扩增培养大鼠胚胎皮质来源的NSCs,电穿孔法转导Nurr1表达质粒（pcDNA3.1-hygro-Nurr1）至NSCs,经潮霉素筛选携带Nurr1基因的NSCs,撤除表皮细胞生长因子和碱性成纤维生长因子（EGF/bFGF）,添加ATRA、Egb,诱导分化NSCs 7天后,收集细胞,制成细胞悬液,供移植。另外,将转染Nurr1基因而未经ATRA/Egb诱导分化的NSCs,ATRA/Egb诱导分化而未转染Nurr1基因的NSCs,没有做特殊处理自然分化的NSCs分别制备成细胞悬液,供移植作为对照组。将建模成功的46只帕金森病SD大鼠模型随机分为四组,即（1）Nurr1+RA/Egb组:接受Nurr1基因修饰结合ATRA/Egb诱导分化的NSCs移植组;（2）Nurr1组:接受Nurr1基因修饰而未经ATRA/Egb诱导分化的NSCs移植组;（3）RA/Egb组:接受ATRA/Egb诱导分化而未Nurr1基因修饰的NSCs组;（4）接受没有特殊处理的让其自然分化的NSCs组。将溴尿嘧啶（Brdu）标记的单纯胚胎NSCs（NSCs组）、RA/Egb诱导分化的NSCs（RA/Egb组）、单纯转Nurr1基因的NSCs（Nurr1组）和转Nurr1基因联合RA/Egb诱导分化的NSCs（Nurr1+RA/Egb组）分别移植至模型鼠右侧纹状体。在移植后不同时点观察其旋转行为的改善。采用免疫组化染色方法检测酪氨酸羟化酶（TH）、核受体相关因子（Nurr1）、神经丝巢蛋白（nestin）表达及Brdu标记情况,观察移植的NSCs在体内的存活、迁移,并进行TH阳性细胞计数观察移植后脑内移植部位TH阳性细胞数的变化。结果:各组动物脑内移植后动物旋转行为较前均有改善,尤以Nurr1+RA/Egb组改善最明显。免疫组化可见各组移植区均有TH阳性细胞表达,其中Nurr1+RA/Egb组可发现更多的TH阳性细胞,可见TH阳性细胞有突起,形态更成熟。在Nurr1组和Nurr1+RA/Egb组移植区可见有Nurr1散在表达,但nestin检测未见有阳性表达。结论:转Nurr1基因联合全反式维甲酸及银杏提取物诱导分化后的神经干细胞脑内移植后可以改善PD模型旋转行为。移植入PD大鼠模型脑内的细胞可以存活、迁移,这些部分细胞可表达TH和Nurr1,这些结果提示Nurr1基因结合全反式维甲酸及银杏提取物诱导分化的神经干细胞有可能发展成为PD细胞移植治疗有用的细胞来源。

论文目录

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• 正文
• 1. 前言
• 2. 材料和方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 5. 结论
• 6. 参考文献
• 附录
• 致谢
• 综述
• 参考文献