一、碱性成纤维细胞因子在枯草芽孢杆菌BS224中的表达（论文文献综述）
苏畅[1]（2021）在《功能角蛋白制备用酶在Bacillus subtilis中的高效表达与改造》文中研究指明角蛋白（Keratin）作为一种天然生物材料,具有良好的生物相容性与生物可降解性,在组织工程材料领域表现出广阔的应用前景。角蛋白酶（Keratinase）因具备独特的高效降解角蛋白纤维的特性,可有效提取毛发中的可溶性功能角蛋白,在角蛋白质资源的生物降解与角蛋白生物材料制备方面具有重要的研究价值与应用潜力。鉴于角蛋白酶的产量低和稳定性差是限制其工业化应用的主要原因,本研究以高效生产角蛋白酶及改善其热稳定性为目标,首先通过前导肽工程和启动子工程改造策略实现角蛋白酶的高效表达,进而应用计算机辅助设计与分子进化相结合的方法提高角蛋白酶的热稳定性;并以该角蛋白酶为催化剂,探索羊毛角蛋白的生物制备工艺,主要研究结果如下:（1）利用前导肽工程改造提高角蛋白酶的活性前导肽作为分子内伴侣,能够有效指导成熟酶的正确折叠以及活性构象的形成。本研究通过对重组Bacillus subtilis角蛋白酶Ker Bp的前导肽区域进行逐段截短,证明前导肽全长对成熟酶的表达具有至关重要的作用。通过对前导肽切割位点（P1）的氨基酸进行替换,发现芳香族疏水氨基酸苯丙氨酸有利于前导肽的切割,突变体Y（P1）F使角蛋白酶活性提升了1.7倍。另外,基于同源序列比对,对前导肽序列中非保守位点进行定点突变,获得6个酶活性显着提升的突变体,其中I（62）K突变体使角蛋白酶活性提高约2.2倍。进一步对上述6个位点构建饱和突变体文库,经过3轮有效筛选获得15个活性超过800 U·m L-1的突变体,其中突变体M7的酶活可达到1114 U·m L-1,较野生型提高6倍。（2）通过启动子元件改造调控宿主细胞生长与产酶过程研究发现随着活性和产量的提升,角蛋白酶对菌体内源性蛋白表现出降解能力,影响了B.subtilis宿主细胞正常的生长过程,导致菌体及产酶量的减少。本研究采用启动子元件改造调控宿主细胞生长与产酶过程,发现通过菌体密度依赖型启动子Papr E代替组成型启动子PHpa II,使产酶生物量获得提升,最高菌浓(OD600 nm)从8提高到10;酶活最高可达到2300 U·m L-1,是使用组成型启动子的2倍。通过对启动子的拷贝数进行优化,获得了重组菌角蛋白酶活性最高的二串联体启动子Papr E-Papr E,酶活可达3080U·m L-1。将启动子的-10区和-35区序列突变为σ因子识别的保守序列,进一步使酶活提高到3500 U·m L-1。另外,对培养基的碳源进行优化,促进了菌体的生长与积累,结果表明添加2%的葡萄糖能够延长菌体的生长时间,最大菌浓可达到15.6。同时产酶量也随着菌体生长时间的延长而增加,培养84 h后达到峰值4200 U·m L-1。（3）借助计算机辅助策略改造关键Loop区域提高角蛋白酶热稳定性角蛋白酶的热稳定性是其在高温下高效降解羊毛纤维等角蛋白质资源的先决条件,本研究基于计算机辅助设计与蛋白质工程改造相结合,提升角蛋白酶Ker Bp的热稳定性。通过计算机辅助计算与分析,预测了角蛋白酶Ker Bp的3段高柔性Loop以及一个与钙离子结合相关的Loop,并定位了其中对稳定性贡献较小的氨基酸残基。另外,基于同源序列比对分析,将Ker Bp序列中出现的“低频氨基酸”残基替换为同源序列中该位点的“高频氨基酸”。共构建了65个单点突变体,采取虚实结合的筛选策略,在保持酶活的基础上,获得了6个热稳定性提升的突变体,进一步通过组合突变构建获得6个位点的协同改造突变体,使角蛋白酶在60℃下的失活半衰期从17.3 min提高至66.1 min,并且最适反应温度从40℃提高至60℃。（4）利用角蛋白酶对羊毛纤维的可控降解制备大分子功能角蛋白角蛋白是性能卓越、极具应用潜力的生物材料,但由于天然的角蛋白结构紧密、可溶性差,难以直接作为生物材料进行应用。而采用化学法制备角蛋白通常会破坏分子上的活性基团,因此探索大分子、可溶性角蛋白的酶法制备具有重要意义。本研究利用自主开发的角蛋白酶水解废弃羊毛,制备出主要分子量约为45 k Da和28 k Da的可溶性角蛋白,其羊毛溶解率达68.1%,角蛋白提取率为33.7%。详细考察了羊毛的酶解过程,发现角蛋白酶能够从羊毛纤维的鳞片层进行逐层水解,最终实现羊毛复杂结构的破坏及溶解,通过对过程条件的控制,能够提取获得大片段可溶性羊毛角蛋白。体外评价结果显示,该角蛋白提取物具有良好的生物相容性,表现出明显的促细胞增殖和迁移的作用,并且具有较强的抗氧化性。为探索角蛋白提取物在生物组织材料领域的应用,研究利用角蛋白自组装特性制备获得水凝胶;小鼠成纤维细胞的体外培养实验结果表明该角蛋白凝胶具有良好的生物相容性,可作为细胞生长的支架材料。小鼠体内伤口促愈实验探究表明其能够通过促进成纤维细胞的增长和迁移以及加速形成新生血管和胶原沉积达到促进伤口修复的效果,证明该角蛋白水凝胶是一种优良的伤口敷料。
张祥胤[2]（2021）在《枯草芽孢杆菌对肉鸡肠道黏膜屏障与TLR通路的影响及机制研究》文中研究指明肠道是重要的消化器官,同时也是机体最大的免疫器官,肠道屏障的完整与免疫功能的健全是机体健康的保障。枯草芽孢杆菌是一种有益菌,目前的研究主要集中在其促生长方面,虽也有关于其在维持肠道屏障与抑制炎症方面的报道,但枯草芽孢杆菌影响肠道屏障与免疫的机制尚不清楚。枯草芽孢杆菌的剂量和肉鸡的日龄是否会对枯草芽孢杆菌的效果造成影响也未见报道。本研究通过在日粮中添加不同剂量的枯草芽孢杆菌以及在不同时间采样,研究枯草芽孢杆菌剂量对不同日龄白羽肉鸡肠道黏膜屏障和炎症的影响及其机制。本研究选择白羽肉鸡作为试验动物,60000只肉鸡随机分为3个组,分别为基础日粮（基础日粮组,Basic Diet Group,BD）,添加1‰（低剂量组,Low Dose Group,LD）或1.5‰（高剂量组,High Dose Group,HD）枯草芽孢杆菌的试验组,每组8个重复。分别于20 d与40 d从每个重复中随机选取一只,采集血液样本进行血常规检测;采取肠道和脾脏组织制成石蜡切片,观察形态学结构;将肠道组织制成电镜样品,观察绒毛表面超微结构;采集肠道组织通过RT-q PCR检测肠道紧密连接蛋白、Toll样受体（tolllike receptors,TLRs）通路与胆汁酸通路关键基因表达;Western blot检测核因子κB（Nuclear factor kappa B,NF-κB）与法尼酯X受体（Farnesoid X receptor,FXR）蛋白表达情况;染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation,CHIP）检测FXR启动子区域组蛋白修饰情况。结果如下:1.对照组与试验组肠道绒毛形态完整,与对照组相比20 d和40 d十二指肠LD组绒毛长度增加（P<0.05）,40 d十二指肠、空肠HD组隐窝深度增加（P<0.05）;扫描电镜下,试验组与对照组肠绒毛表面杯状细胞与柱状上皮细胞形态正常,没有差异。q PCR结果显示,试验组紧密连接蛋白基因表达显着降低（P<0.05）,且40 d试验组与对照组有差异的紧密连接蛋白比20 d更多,但紧密连接蛋白基因的变化没有剂量依赖性。2.血常规检测结果显示炎性细胞数量没有差异;脾脏HE染色结果未发现白髓面积有显着差异。q PCR结果显示20 d十二指肠HD组TLRs m RNA水平显着低于LD组（P<0.05）,试验组骨髓分化初级反应蛋白MYD88（Myeloid differentiation primary response protein MYD88,MYD88）显着高于BD（P<0.05）;40 d十二指肠空肠与回肠试验组Tlr4、Tlr5显着（P<0.05）或极显着降低（P<0.01）,但不呈现剂量依赖性,空肠LD组NF-κB显着高于BD,其他肠道NF-κB、白介素1β（Interleukin-1β,IL-1β）、肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factorα,TNF-α）没有显着差异（P>0.05）;Western Blot结果显示20 d回肠NF-κB蛋白表达没有差异（P>0.05）,40 d显着降低（P<0.05）,但20 d与40 d试验组p-NF-κB与BD组相比均没有显着差异（P>0.05）。3.与对照组相比,20 d空肠HD组编码FXR的基因Nr1h4显着升高（P<0.05）;40 d十二指肠、空肠与回肠HD组Nr1h4均显着降低（P<0.05）,回肠LD组Nr1h4极显着低于BD组（P<0.01）;20 d十二指肠和空肠编码类维生素A X受体α（Retinoid X receptorα,RXRA）的基因Nr2b1极显着降低（P<0.01）,40 d十二指肠Nr2b1显着降低（P<0.05）;40 d回肠高剂量组编码根尖钠依赖性胆汁酸转运蛋白（Apical sodiumdependent bile acid transporter,ASBT）的基因Slc10a2显着降低（P<0.05）;40 d回肠LD组FXR蛋白表达显着降低（P<0.05）;FXR启动子HD组组蛋白H3乙酰化（acetylation of histone H3 protein subunit,H3Ac）水平显着降低（P<0.05）,试验组H3K4三甲基化（trimethylation of lysine 4 on histone H3 protein subunit,H3K4me3）显着降低（P<0.05）,LD组H3K9单甲基化（monomethylation of lysine 9 on histone H3 protein subunit,H3K9me）显着降低（P<0.05）,试验组H3K27三甲基化（trimethylation of lysine27 on histone H3 protein subunit,H3K27me3）水平显着低于对照组（P<0.05）。以上结果表明饲料中添加枯草芽孢杆菌会增加绒毛长度与隐窝深度,降低肠道紧密连接蛋白表达,且随肉鸡日龄增加枯草芽孢杆菌的作用更显着,血液检测结果显示试验组与对照组均没有发生炎症。q PCR结果显示试验组Tlr减少,Western Blot结果表明NF-κB蛋白表达降低,提示TLR通路受到抑制。胆汁酸通路基因Slc10a2与Nr1h4降低,40 d FXR蛋白表达降低。通过CHIP对FXR启动子区域组蛋白修饰情况进行检测,结果显示H3K4me3水平降低,因此推测枯草芽孢杆菌影响FXR启动子组蛋白修饰,使ASBT与FXR基因表达减少,FXR蛋白表达降低,抑制胆汁酸通路进而导致肠道紧密连接蛋白减少,吸收功能增强,TLR通路受到抑制;枯草芽孢杆菌的效果没有剂量依赖性,但具有时间依赖性。
姜涛[3]（2020）在《鼠IFN-γ和IL-10细胞因子的表达及单克隆抗体的制备》文中研究表明细胞因子是一类小分子可溶性蛋白,对动物的固有免疫和适应性免疫起着十分重要的作用。IFN-γ和IL-10作为较为重要的细胞因子,吸引了众多研究者的关注。IFN-γ能直接调动体内的多种免疫原细胞的增殖与分化,参与所有的I型辅助T细胞（Th1细胞）的免疫反应;IL-10能抑制炎症反应并提高体内免疫系统对外来细菌和病毒的应答反应。本实验首先利用基因工程技术,表达纯化得到了鼠源的IFN-γ和IL-10蛋白。利用单克隆抗体技术,筛选出15株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株（分泌IFN-γ抗体的杂交瘤细胞株2株,分泌IL-10抗体的杂交瘤细胞株13株）。对分泌IFN-γ抗体的杂交瘤细胞株2D8进行亚型鉴定结果为Ig G2a型。将杂交瘤细胞2D8按照每只106个的剂量注入提前用弗氏不完全佐剂处理的小鼠腹腔,通过腹水采集和纯化获得了IFN-γ抗体。本工作中表达纯化得到的IFN-γ和IL-10蛋白,可以为其他研究者进一步研究这两种鼠源细胞因子结构与功能及其相关疾病提供重要的物质基础,通过单克隆抗体技术得到能稳定分泌IFN-γ和IL-10抗体的杂交瘤细胞,可以为后续建立双抗夹心ELISA方法检测这两种细胞因子提供关键的抗体支持。
李鑫[4]（2020）在《重组人EGF、bFGF的高效可溶性表达研究及活性检测》文中认为表皮细胞生长因子（Epidermal Growth Factor,EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（Basic Fibroblast Growth Factor,bFGF）都属于细胞生长因子家族中的成员,有广泛的生物学效应。本研究针对人源EGF和bFGF基因序列设计了多个突变体,如:将EGF序列中第4位丝氨酸替换为苏氨酸;在EGF序列中添加亮氨酸和苏氨酸;将bFGF序列中第25位丝氨酸替换为半胱氨酸等。将合成的EGF和bFGF基因序列连接至融合了PLB1结构域或DsbA伴侣标签的pET-28a和pET-42a表达载体中构建重组质粒,将测序结果比对正确的重组质粒转化入E.coli BL21（DE3）感受态细胞中进行表达。实验过程中,在摇瓶小试阶段首先筛选出优势单克隆菌株,并进行建库保存,发酵罐放大培养时考察不同的培养基和培养条件对工程菌发酵密度值的影响,优化EGF和bFGF融合蛋白的表达条件,其次对比不同的破壁缓冲液和洗脱缓冲液对菌体蛋白在层析柱中的分离特性和样品组间分离度的影响,交替使用镍离子亲和层析和离子交换层析纯化目的蛋白。最后采用MTT比色法检测EGF和bFGF蛋白原液的生物学活性,检测结果表明两种蛋白原液均能促进NIH-3T3细胞增殖,且EGF供试品效价为3.829×105IU/mg;bFGF供试品效价为3.518×105IU/mg。本研究在上游设计阶段构建了多种EGF和bFGF突变序列,提高了目的蛋白表达量和可溶性表达占比,在下游制备阶段优化了基因工程菌的发酵培养条件,在分离纯化阶段秉承步骤越少,收率越高的原则,将层析操作降至两步以下,并使目的产物纯度达到90%以上,满足后续特异性鉴定和活性检测等实验的要求,验证阶段,通过Western Blot实验检验蛋白原液结构正确,并根据药典的准则建立了一种科学、严谨、成本低的生物学活性检测方法,应用该方法检测EGF和bFGF两种蛋白原液生物学活性,为EGF和bFGF的产业化生产奠定了基础。
廖海洪[5]（2019）在《复合益生菌及板蓝根多糖对断奶仔猪生长性能和免疫功能的影响研究》文中认为为了缓解仔猪断奶应激,减少胃肠道受到的影响变化,降低保种场仔猪在断奶早期的生长抑制等问题,本试验在断奶仔猪的饲料中添加复合益生菌和板蓝根多糖,观察断奶仔猪的生长性能和免疫功能等在复合益生菌和板蓝根多糖作用下的效果。（1）复合益生菌、板蓝根多糖对断奶仔猪生长性能的影响。试验选取35±5日龄品种为陆川猪的断奶仔猪24头,随机分成4组,每组2个重复,每个重复3头猪。对照组只给予基础日粮,3个处理组分别在基础日粮中添加0.30%复合益生菌、0.08%板蓝根多糖、0.30%复合益生菌+0.08%板蓝根多糖饲喂处理。试验期为40 d,试验开始后分别在第1天、第20天、第40天的早晨,空腹称重;记录每天的投料量和饲喂后的剩料量。结果显示,各组仔猪的初始平均体重差异呈现并不显着（P>0.05）。在试验的第1阶段（0-20 d）,平均日采食量、平均日增重以及料重比均未呈现显着差异（P>0.05）;第2阶段（21-40 d）,复合益生菌+板蓝根多糖组的料重比较对照组低36.00%,差异显着（P<0.05）。（2）复合益生菌、板蓝根多糖对断奶仔猪免疫水平的影响。在上述试验基础上分别于第20 d和40 d早上,每个重复随机选择1头健康断奶仔猪采血,测定血清中的生化指标和免疫指标。结果表明,在第20 d,3个处理组的ALT、ALP、AST、BUN含量增加不显着（P>0.05）,而LDH含量提高显着（P<0.05）,TP含量降低（P<0.05）;在第40 d时,3个处理组中ALT、ALP含量增加差异显着,DH、AST、BUN提高不明显,复合益生菌+板蓝根多糖组的TP含量高于对照组（P<0.05）。在第20 d,处理组的Ig A、Ig G、Ig M的含量差异均呈现不显着,第40 d时,复合益生菌+板蓝根多糖组中的Ig A、Ig G含量较对照组低而Ig M含量比对照组高,组间的含量差异均不显着（P>0.05）。（3）复合益生菌、板蓝根多糖对断奶仔猪粪便菌群及腹泻情况的影响。分别于试验的第20 d和40 d早上,每个重复随机选择1头健康断奶仔猪采集新鲜粪样,测定乳酸菌和大肠杆菌的数量;每天早上观察仔猪的排粪情况,计算腹泻率。在整个试验阶段,与正常对照组相比,各处理组的大肠杆菌和乳酸菌数量均无显着差异（P>0.05）;处理组复合益生菌组、板蓝根多糖组、复合益生菌+板蓝根多糖组的腹泻率分别降低了52.53%、26.26%、58.08%,差异均呈现不显着（P>0.05）。（4）复合益生菌、板蓝根多糖对断奶仔猪消化功能的影响。分别在试验第16～20 d、第36～40 d,连续5天,每处理选择1头仔猪进行粪样采集,测定养分消化率。在试验第1阶段,复合益生菌组、板蓝根多糖组、复合益生菌+板蓝根多糖组粗蛋白的消化率分别增高了5.40%（P<0.05）、7.51%（P<0.05）、3.11%（P>0.05）;磷消化率分别提高了6.52%、10.37%、6.01%,差异均呈现显着（P<0.05）;钙表观消化率分别提高了9.01%、10.25%、7.91%,差异也均呈现显着（P<0.05）。在试验第2阶段,粗蛋白表观消化率分别提高了5.59%（P<0.05）、4.99%（P<0.05）、3.34%（P>0.05）;磷表观消化率分别提高了11.00%、13.52%、10.65%,呈现显着差异（P<0.05）;钙表观消化率分别提高了5.42%、7.33%、6.81%,差异显着（P<0.05）。试验结果表明:复合益生菌和板蓝根多糖复合作用能够在一定程度上提高断奶仔猪的生长性能、免疫功能和消化功能,还对断奶仔猪粪便菌群及腹泻情况具有一定的改善作用,这为复合益生菌和板蓝根多糖在今后生产养殖中的应用提供了依据。
金鑫[6]（2019）在《酿酒酵母甘露聚糖对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1表达影响及其信号通路研究》文中指出绵羊瘤胃上皮作为与环境接触的免疫界面,能够分泌具有针对各种病原体的抗微生物肽（Antimicrobial peptides,AMPs）。防御素作为机体内正常产生的AMPs,具有广谱的抗微生物活性,而绵羊β-防御素-1（Sheep β-defensin-1,SBD-1）作为防御素家族的一员,在整个胃肠道内广泛表达,因此SBD-1可能在绵羊胃肠道先天性免疫中发挥着重要作用。本课题组前期的研究表明酿酒酵母菌及其全细胞壁均能诱导绵羊瘤胃上皮细胞（Ovine ruminal epithelial cells,ORECs）内SBD-1的表达,而甘露聚糖作为酿酒酵母细胞壁的主要成分,具有刺激先天性和适应性免疫反应功能。因此,本试验首先对ORECs的培养、冻存和复苏方法进行研究,然后研究了酿酒酵母甘露聚糖对ORECs SBD-1的表达影响,最后对甘露聚糖诱导SBD-1表达所激活的信号通路进行探索。具体研究内容及结果如下:（1）采用胰蛋白酶连续消化法对瘤胃组织分别进行7次不同时间（40、30、20、10、10、8和5 min）的消化,并对每次消化后的瘤胃组织和细胞进行观察,以确定消化程度。结果发现第4次消化后即可开始收集细胞,并进行原代培养。同时运用差时消化法和差速贴壁法对培养的细胞进行纯化,并利用免疫组化、免疫荧光、细胞生长曲线和RT-PCR方法证实所培养的细胞为ORECs。然后通过检测复苏后的细胞活力和24 h贴壁率发现冻存液的配制比例为VFBS:VDMEM:VDMSO=9:0:1时,冷冻保护效果较好。最后对复苏后的ORECs生物学活性进行检测,结果表明复苏后的细胞同样具有原代ORECs的生物学特性,可用于后续试验研究。（2）用不同浓度（0、10、50、100、200和400 μg/mL）的甘露聚糖刺激ORECs 8 h后,筛选出甘露聚糖诱导SBD-1表达的最佳浓度;然后用最适浓度的甘露聚糖刺激ORECs不同时间（0、2、4、8、12和24 h）后,筛选出甘露聚糖诱导SBD-1表达的最佳时间。qPCR和ELISA结果均显示甘露聚糖能够诱导ORECs SBD-1的表达,且当浓度为50 μg/mL的甘露聚糖刺激ORECs4h时SBD-1的表达量达到最大。（3）采用Western blot、RT-PCR、免疫组化、免疫荧光、qPCR和ELISA方法对甘露聚糖诱导SBD-1表达所激活的信号通路进行研究。结果表明:膜受体树突状细胞相关 C 型凝集素 2（Dendritic-cell-associated C-type lectin 2,Dectin-2）和信号衔接蛋白脾脏酪氨酸激酶（Spleen tyrosine kinase,Syk）在ORECs内均表达,并且用Dectin-2和TLR-2的siRNA或特异性封闭抗体处理ORECs后均可以减弱甘露聚糖诱导SBD-1的表达,且阻断Dectin-2对SBD-1表达的抑制作用更明显。然后用Syk siRNA或Syk特异性抑制剂R406处理细胞后同样发现阻断Syk能够降低甘露聚糖诱导SBD-1的表达。最后分别用p38、JNK、ERK1/2和NF-κB信号通路的特异性抑制剂处理ORECs后均显着降低甘露聚糖诱导SBD-1的表达,且p38通路抑制剂效果最明显。本研究通过消化时间的确定,成功培养出了 ORECs。冻存液的配制比例为VFBS:VDMEM:VDMSO=9:0:1时,对ORECs的冷冻保护效果较好,且复苏后的细胞同样具有原代ORECs的生物学特性。此外,甘露聚糖能够诱导ORECs SBD-1的表达,且膜受体Dectin-2和TLR-2,信号衔接蛋白Syk以及下游的信号通路p38、JNK、ERK1/2和NF-κB均参与甘露聚糖诱导SBD-1的表达过程,但可能以Dectin-2-Syk-p38信号通路为主要的信号通路。
周宇[7]（2019）在《鸡表皮生长因子在乳酸乳球菌中的表达及初步应用》文中认为表皮细胞生长因子（epidermal growth factor,EGF）是一种能够促进细胞增殖、分化的小分子多肽,在动物机体内一系列的生理过程中扮演重要的角色。人们在研究哺乳动物的EGF时发现其可影响动物的生长性能、免疫功能及肠道发育,但是目前有关鸡表皮生长因子（gallus epidermal growth factor,gEGF）的研究却很少有提及,而雏鸡抵抗力较弱,其生长发育易受到不良条件的影响,因此本试验拟采用乳酸乳球菌非抗性筛选表达系统进行外源表达gEGF,并通过体内外试验对其生物学功能进行初步研究。以下是研究内容及结果。人工合成SPusp45和gEGF融合基因片段,将此目的基因克隆至表达载体pNZ8149,之后电转化至乳酸乳球菌NZ3900,获得了能够分泌表达gEGF的工程菌LL-pNZ8149-gEGF,重组工程菌经Nisin诱导后,利用Western blot和SDS-PAGE检测到菌体和上清中表达的蛋白,此外,还利用HisTrap柱成功从上清中纯化出gEGF蛋白。体外培养鸡胚成纤维细胞UMNSAH/DF-1至单层细胞的60%左右后饥饿培养12 h,之后以不同浓度的gEGF蛋白溶液分别刺激UMNSAH/DF-1细胞,观察gEGF对UMNSAH/DF-1细胞的增殖活性的影响。结果发现,1-10μg/mL gEGF均可显着促进UMNSAH/DF-1细胞的增殖,5μg/mL gEGF的促进作用最强。以5 d龄雏鸡作为试验动物,将其分为3组,每组每日分别灌服1ml M17培养基、LL-pNZ8149诱导上清液、LL-pNZ8149-gEGF诱导上清液,连续灌服2周,记录每天的采食量、体重,计算1周及2周内平均日采食量、平均日增重以及料肉比,以此作为评价gEGF对肉鸡生长性能影响的依据,结果发现:gEGF可显着提高肉鸡末重、平均日增重、平均日采食量以及2周内的料肉比;2周后处死鸡群,取出免疫器官脾脏、胸腺、法氏囊,计算免疫器官指数,翅静脉采血检测血清IgG、IgA水平,之后分别刮取十二指肠、空肠、回肠黏膜测定黏膜sIgA水平,以此作为评价gEGF对肉鸡免疫功能影响的依据,结果发现:gEGF可显着提高胸腺、脾脏指数以及血清IgG、IgA以及十二指肠黏膜sIgA水平;此外,2周后分别取十二指肠、空肠、回肠组织制作组织切片,分析各肠段绒毛高度,隐窝深度的变化,以此作为评价gEGF对肉鸡肠道发育影响的依据,结果发现:gEGF可显着提高十二指肠,空肠绒毛高度,降低十二指肠隐窝深度。本试验成功实现了gEGF在乳酸乳球菌非抗性筛选表达系统的表达,所表达的产物具有促进UMNSAH/DF-1细胞增殖的活性,动物实验表明,gEGF具有改善肉鸡的生长性能,提高免疫功能以及促进肠道发育的作用。
李晨阳[8]（2019）在《鲫鱼TGFβ1基因的克隆及蛋白功能初探》文中研究指明转化生长因子β1（TGFβ1）是一种多功能的细胞因子,在多种细胞的生长、分化和免疫功能中起着重要作用。本试验采用PCR、生物信息学、实时荧光定量PCR、原核表达、蛋白纯化和液相质谱检测等技术方法对鲫鱼TGFβ1基因结构特征、表达调控以及TGFβ1蛋白在鲫鱼体内的功能进行探究。主要结果如下:获得鲫鱼TGFβ1基因cDNA序列的CDS区序列长1134 bp,共编码377个氨基酸,具有由22个氨基酸构成的信号肽,在胞外表达不属于跨膜蛋白,氨基酸序列上的第280个氨基酸到第376个氨基酸可形成TGFβ样结构域,在鱼类中较为保守,与哺乳动物在进化关系上距离较远。鲫鱼TGFβ1基因对复合益生菌的应答显示:与不添加益生菌的对照组（A）相比,在第30 d时TGFβ1在添加沼泽红假单胞菌组（B）、添加沼泽红假单胞菌+枯草芽孢杆菌组（C）和添加沼泽红假单胞菌+枯草芽孢杆菌+屎肠球菌组（D）心脏、肌肉、肝脏中的表达量极显着上升（P<0.01）,在第20 d时TGFβ1在B组肌肉中表达上调极显着（P<0.01）。TGFβ1下游通路基因TAK-1、SMAD2、SMAD3、SMAD7的检测结果显示:与对照组A相比,在30 d时TAK-1在B组肌肉中表达量极显着降低（P<0.01）,在20 d时SMAD2、SMAD3、SMAD7在B组肌肉中表达量极显着升高（P<0.01）。成功构建表达载体TGFβ1-pDE2,SDS-PAGE电泳显示获得大小约为43 kDa的目的蛋白,纯化后蛋白定量浓度为641.42μg/mL,液相质谱检测表达蛋白为TGFβ1蛋白,肽段评分856,序列覆盖率为50%。表达出的TGFβ1蛋白具有一定的活性与功能。血清学指标结果显示,与注射PBS鲫鱼对照组（S1）相比,在24 h时注射TGFβ1蛋白鲫鱼组（S2）和灌食TGFβ1蛋白鲫鱼组（S3）的碱性磷酸酶和溶菌酶活力极显着上升（P<0.01）,S2组超氧化物歧化酶活力在36 h时极显着上升（P<0.01）。实时荧光定量PCR检测显示,与对照组S1相比,在24 h时S2组和S3组的HSP 30和HSP 47在心脏中表达量极显着升高（P<0.01）,IL-11在心脏中表达量极显着下降（P<0.01）。这表明TGFβ1对鲫鱼免疫机能可能具有一定促进作用。
苗苗,黄昆仑,梁志宏[9]（2017）在《芽孢杆菌表达系统的特点及研究进展》文中研究指明芽孢杆菌表达系统作为基因工程表达系统,因具有外源蛋白易分离纯化、表达的外源蛋白不会形成包涵体、无致病性等多种优势而被广泛的研究和应用,很多种工业酶都在芽孢杆菌表达系统中获得成功表达。本文主要介绍了芽孢杆菌表达系统的研究进展,特点以及其在工业上的应用。对芽孢杆菌表达体系存在的缺陷提出了解决方法,并说明了芽孢杆菌今后发展的主要方向,为芽孢杆菌表达体系的研究提供参考。
杨虎城[10]（2015）在《复合益生菌对罗非鱼免疫相关基因的影响》文中研究表明本研究通过把三种复合益生菌添加到饲料中,分别饲喂罗非鱼（Tilapia）,确定提升免疫保护率最佳的复合益生菌种类,并从分子水平初步探索复合益生菌对罗非鱼免疫力影响的作用机理。试验共分4组,3个试验组和1个对照组。3个试验组用分别添加了等比例的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）+枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）+凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）+粪肠球菌（Enterococcus faecalis）的饲料饲喂罗非鱼,添加量为2‰。饲喂40天,期间每隔10天取罗非鱼肝脏、肾脏、头肾、脾脏以及鳃五个器官,采用实时荧光定量PCR技术检测各器官中环氧化酶-2（COX-2）、白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-a （TNF-a）这三种免疫相关基因的相对表达量变化情况。40天后,以攻毒试验来检测复合益生菌对罗非鱼抗感染保护率的影响。分别给罗非鱼胸鳍基部注射嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和无乳链球菌三种罗非鱼常见致病菌。试验结果表明：三种不同的复合益生菌都显着（P<0.05）诱导罗非鱼五个器官中CoX-2、IL-1β和TNF-a基因的表达,其中地衣枯草组诱导表达效果最明显；基因诱导表达在免疫器官肾脏、头肾和脾脏中要比非免疫器官肝和鳃中明显；地衣枯草组提高了罗非鱼对嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）和无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）的抗感染保护率；地衣凝结组提高了罗非鱼对嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌的抗感染保护率。
二、碱性成纤维细胞因子在枯草芽孢杆菌BS224中的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、碱性成纤维细胞因子在枯草芽孢杆菌BS224中的表达（论文提纲范文）
（1）功能角蛋白制备用酶在Bacillus subtilis中的高效表达与改造（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 角蛋白概述 |
| 1.1.1 角蛋白的结构 |
| 1.1.2 角蛋白的性质 |
| 1.1.3 角蛋白的应用 |
| 1.1.4 角蛋白的提取 |
| 1.2 角蛋白酶概述 |
| 1.2.1 角蛋白酶的来源和理化性质 |
| 1.2.2 角蛋白酶的降解机制和水解特异性 |
| 1.3 角蛋白酶的应用 |
| 1.3.1 角蛋白的生物降解 |
| 1.3.2 化妆品和药品 |
| 1.3.3 其他应用 |
| 1.4 角蛋白酶的克隆表达 |
| 1.4.1 角蛋白酶序列 |
| 1.4.2 异源表达体系 |
| 1.5 角蛋白酶的分子改造 |
| 1.5.1 角蛋白酶结构 |
| 1.5.2 分子改造策略 |
| 1.6 立项依据和研究意义 |
| 1.7 主要研究内容 |
| 第二章 前导肽改造提升角蛋白酶活性 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 基因、菌株和质粒 |
| 2.2.2 主要试剂和仪器 |
| 2.2.3 培养基和培养条件 |
| 2.2.4 引物 |
| 2.2.5 角蛋白酶活性的测定 |
| 2.2.6 同源模型的构建 |
| 2.2.7 前导肽工程改造 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 截短突变验证前导肽的功能 |
| 2.3.2 前导肽切割位点氨基酸替换对角蛋白酶表达的影响 |
| 2.3.3 前导肽区域定点突变 |
| 2.3.4 多位点组合饱和突变 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 启动子元件改造调控宿主细胞生长与产酶 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株和质粒 |
| 3.2.2 主要试剂和仪器 |
| 3.2.3 培养基和培养条件 |
| 3.2.4 引物 |
| 3.2.5 角蛋白酶对菌体生长的影响探究 |
| 3.2.6 启动子工程改造策略与方法 |
| 3.2.7 角蛋白酶活性的测定 |
| 3.2.8 碳源补充优化 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 角蛋白酶的表达对宿主细胞生长的影响 |
| 3.3.2 菌体密度依赖型启动子替换组成型启动子 |
| 3.3.3 利用串联apr E启动子提高角蛋白酶产量 |
| 3.3.4 启动子核心区域序列优化提高启动子活性 |
| 3.3.5 补充碳源提高菌体前期积累 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 基于Loop结构的设计与改造提升角蛋白酶热稳定性 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株和质粒 |
| 4.2.2 主要试剂和仪器 |
| 4.2.3 培养基和培养条件 |
| 4.2.4 引物 |
| 4.2.5 不稳定Loop区域的预测与分析 |
| 4.2.6 突变位点的选择与分析 |
| 4.2.7 钙离子结合位点的预测与分析 |
| 4.2.8 序列趋同性突变位点及突变类型的确定 |
| 4.2.9 突变体重组质粒构建及转化 |
| 4.2.10 角蛋白酶活性测定 |
| 4.2.11 突变体筛选及热稳定性评价 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 基于计算机辅助分析的不稳定Loop区域预测 |
| 4.3.2 基于B-Factor与 RMSF的突变位点选择 |
| 4.3.3 基于ΔΔG的突变氨基酸选择 |
| 4.3.4 突变体重组菌的活性测定与筛选 |
| 4.3.5 钙离子结合相关Loop改造策略的热稳定性提升 |
| 4.3.6 基于序列一致性突变策略的热稳定性提升 |
| 4.3.7 优势位点的组合突变 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 角蛋白酶对羊毛的可控降解及功能角蛋白的表征与应用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 样品 |
| 5.2.2 主要试剂和仪器 |
| 5.2.3 可溶性角蛋白的酶法制备 |
| 5.2.4 可溶性角蛋白生物相容性评价 |
| 5.2.5 角蛋白自组装凝胶的制备 |
| 5.2.6 角蛋白凝胶用于细胞的体外培养 |
| 5.2.7 角蛋白凝胶促创伤愈合的小鼠体内评价 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 角蛋白酶提取羊毛角蛋白 |
| 5.3.2 可溶性羊毛角蛋白提取物的结构表征 |
| 5.3.3 .可溶性羊毛角蛋白提取物的性能表征 |
| 5.3.4 角蛋白自组装凝胶的制备 |
| 5.3.5 角蛋白凝胶冻干海绵用于细胞体外培养 |
| 5.3.6 角蛋白凝胶促进小鼠创伤愈合 |
| 5.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（2）枯草芽孢杆菌对肉鸡肠道黏膜屏障与TLR通路的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文对照表 |
| 第一章 影响肠道黏膜屏障的研究进展 |
| 1.1 枯草芽孢杆菌对肠道黏膜屏障的影响 |
| 1.1.1 益生菌与机体关系 |
| 1.1.2 枯草芽孢杆菌对肠道黏膜屏障的影响 |
| 1.2 肠道屏障 |
| 1.2.1 物理屏障 |
| 1.2.2 生化屏障 |
| 1.2.3 免疫屏障 |
| 1.3 TLR通路在肠道黏膜屏障中的作用 |
| 1.4 核受体FXR在肠道黏膜屏障中的作用 |
| 1.4.1 FXR与胆汁酸代谢 |
| 1.4.2 FXR与肠道菌群 |
| 1.4.3 FXR与免疫 |
| 1.5 组蛋白修饰与DNA甲基化在肠道黏膜中的作用 |
| 1.5.1 DNA甲基化的作用 |
| 1.5.2 肠道菌群对组蛋白修饰的影响 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 第二章 枯草芽孢杆菌对肉鸡肠道屏障的影响 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验动物及试验用菌 |
| 2.1.2 试验日粮 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 试验动物分组和试验设计 |
| 2.2.2 样品采集 |
| 2.2.3 肠道组织石蜡切片的制备与HE染色 |
| 2.2.4 肠道组织总RNA提取 |
| 2.2.5 反转录 |
| 2.2.6 引物设计 |
| 2.2.7 qRT-PCR |
| 2.2.8 数据处理 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 肠道组织形态学观察 |
| 2.3.2 肠道组织扫描电镜结构观察 |
| 2.3.3 肠道组织紧密连接蛋白m RNA表达情况 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 枯草芽孢杆菌对肉鸡肠道TLR通路的影响 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 试验动物及试验用菌 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 试验设计 |
| 3.2.2 样品采集 |
| 3.2.3 脾脏组织石蜡切片的制备与HE染色 |
| 3.2.4 肠道组织RNA提取、反转录与q PCR |
| 3.2.5 引物设计 |
| 3.2.6 回肠组织总蛋白提取与浓度测定 |
| 3.2.7 Western Blot检测回肠NF-κB表达情况 |
| 3.2.8 数据处理 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 血常规检测结果 |
| 3.3.2 脾脏器官指数与红髓白髓比 |
| 3.3.3 肠道TLR通路与炎性因子m RNA表达情况 |
| 3.3.4 关键因子NF-κB在回肠的蛋白表达量 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 枯草芽孢杆菌影响FXR基因与蛋白表达的表观遗传机制 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 试验动物及试验用菌 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 试验设计 |
| 4.2.2 样品采集 |
| 4.2.3 回肠组织RNA提取、反转录与q PCR |
| 4.2.4 引物设计 |
| 4.2.5 回肠组织总蛋白提取与浓度测定 |
| 4.2.6 Western Blot检测回肠FXR的蛋白表达 |
| 4.2.7 CHIP检测回肠FXR组蛋白修饰情况 |
| 4.2.8 CHIP引物设计 |
| 4.2.9 数据分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 肠道FXR与 RXR m RNA表达情况 |
| 4.3.2 回肠FXR蛋白表达情况 |
| 4.3.3 FXR组蛋白修饰情况 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 肠道HE切片制作 |
| 个人简历 |
（3）鼠IFN-γ和IL-10细胞因子的表达及单克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表(Abbreviation) |
| 1 前言 |
| 1.1 细胞因子的概述 |
| 1.1.1 细胞因子的功能 |
| 1.1.2 细胞因子的分类 |
| 1.2 IFN-γ的概述 |
| 1.2.1 IFN-γ的发现 |
| 1.2.2 IFN-γ的结构与功能 |
| 1.2.3 IFN-γ与相关疾病的研究 |
| 1.2.4 IFN-γ检测方法的研究进展 |
| 1.3 IL-10的概述 |
| 1.3.1 IL-10的发现 |
| 1.3.2 IL-10的结构与功能 |
| 1.3.3 IL-10与相关疾病的研究 |
| 1.3.4 IL-10检测方法的研究进展 |
| 1.4 细胞因子的制备 |
| 1.4.1 原核表达系统 |
| 1.4.2 真核表达系统 |
| 1.5 细胞因子单克隆抗体的制备 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 2 IFN-γ和IL-10重组载体的构建与蛋白的表达纯化 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要生物化学试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 主要实验试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 重组质粒的构建 |
| 2.2.1.1 E.coli BL21(DE3)和DH5a感受态细胞的制备 |
| 2.2.1.2 p ET-32a-IFN-γ重组质粒鉴定和转化 |
| 2.2.1.3 p ET-32a-IFN-γ和p ET-28a质粒的提取 |
| 2.2.1.4 PCR扩增IFN-γ基因 |
| 2.2.1.5 IFN-γ基因和p ET-28a载体的双酶切和胶回收 |
| 2.2.1.6 IFN-γ基因和p ET-28a载体的连接 |
| 2.2.1.7 连接产物的转化 |
| 2.2.1.8 阳性转化子的筛选与鉴定 |
| 2.2.1.9 pET-28a-IFN-γ重组质粒鉴定和转化 |
| 2.2.1.10 pET-28a-IL-10 重组质粒鉴定和转化 |
| 2.2.2 重组蛋白的表达与纯化 |
| 2.2.2.1 pET32a-IFN-γ重组蛋白的少量表达 |
| 2.2.2.2 pET28a-IFN-γ重组蛋白的少量表达 |
| 2.2.2.3 IFN-γ重组蛋白表达条件的优化 |
| 2.2.2.4 IFN-γ重组蛋白的大量表达与纯化 |
| 2.2.2.5 IFN-γ重组蛋白的浓度测定 |
| 2.2.2.6 IFN-γ重组蛋白的Western blot鉴定 |
| 2.2.2.7 IL-10重组蛋白的少量表达与可溶性检测 |
| 2.2.2.8 IL-10重组蛋白的大量表达与纯化 |
| 2.2.3 鼠IFN-γ和IL-10单克隆抗体的制备 |
| 2.2.3.1 小鼠免疫 |
| 2.2.3.2 骨髓瘤细胞SP2/0的制备 |
| 2.2.3.3 饲养细胞的制备 |
| 2.2.3.4 免疫脾细胞的制备 |
| 2.2.3.5 细胞融合 |
| 2.2.3.6 杂交瘤细胞的阳性筛选 |
| 2.2.3.7 杂交瘤细胞的亚克隆 |
| 2.2.3.8 杂交瘤细胞株的冻存 |
| 2.2.3.9 杂交瘤细胞株的复苏 |
| 2.2.3.10 单克隆抗体的亚型的鉴定 |
| 2.2.3.11 阳性腹水的制备 |
| 2.2.3.12 单克隆抗体的纯化 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 重组质粒的构建(p ET-28a-IFN-γ) |
| 2.3.1.1 PCR扩增IFN-γ基因 |
| 2.3.1.2 IFN-γ基因和p ET-28a载体的双酶切 |
| 2.3.1.3 阳性转化子的筛选与鉴定 |
| 2.3.2 重组蛋白的表达与纯化 |
| 2.3.2.1 p ET-32a-IFN-γ重组蛋白的少量表达 |
| 2.3.2.2 p ET-28a-IFN-γ重组蛋白的少量表达 |
| 2.3.2.3 IFN-γ重组蛋白表达条件的优化 |
| 2.3.2.4 IFN-γ重组蛋白的大量表达及纯化 |
| 2.3.2.5 IFN-γ重组蛋白的浓度测定 |
| 2.3.2.6 IFN-γ重组蛋白的Western blot鉴定 |
| 2.3.2.7 IL-10重组蛋白的少量表达与可溶性检测 |
| 2.3.2.8 IL-10重组蛋白大量表达与纯化 |
| 2.3.3 鼠IFN-γ和IL-10单克隆抗体的制备 |
| 2.3.3.1 小鼠免疫 |
| 2.3.3.2 骨髓瘤细胞SP2/0的制备 |
| 2.3.3.3 细胞融合 |
| 2.3.3.4 杂交瘤细胞的阳性筛选 |
| 2.3.3.5 杂交瘤细胞的亚克隆 |
| 2.3.3.6 杂交瘤细胞株的冻存 |
| 2.3.3.7 杂交瘤细胞株的复苏 |
| 2.3.3.8 单克隆抗体的亚型的鉴定 |
| 2.3.3.9 阳性腹水的制备 |
| 2.3.3.10 单克隆抗体的纯化 |
| 2.4 小结 |
| 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（4）重组人EGF、bFGF的高效可溶性表达研究及活性检测（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 生长因子家族简述 |
| 1.2.1 表皮细胞生长因子(EGF) |
| 1.2.2 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) |
| 1.3 重组蛋白技术研究进展 |
| 1.4 研究内容、意义及创新性 |
| 1.4.1 研究内容 |
| 1.4.2 意义及创新性 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 试剂、耗材及仪器设备 |
| 2.1.1 实验试剂及耗材 |
| 2.1.2 实验菌株及细胞 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.2 重组质粒的设计与构建 |
| 2.2.3 转化与初步诱导表达验证 |
| 2.2.4 表达条件优化与线性放大 |
| 2.2.5 目的蛋白的分离纯化 |
| 2.2.6 表达产物特异性鉴定 |
| 2.2.7 生物学活性检测(MTT法) |
| 第3章 重组表皮细胞生长因子的制备及检测 |
| 3.1 构建mPLB1-EGF工程菌 |
| 3.1.1 目的基因的表达设计 |
| 3.1.2 目的基因的重组与转化 |
| 3.2 r-EGF融合蛋白的表达 |
| 3.2.1 优化表达条件 |
| 3.2.2 发酵罐放大培养 |
| 3.3 r-EGF融合蛋白的分离纯化 |
| 3.4 r-EGF蛋白原液的特异性鉴定与活性检测 |
| 3.4.1 Western Blot鉴定 |
| 3.4.2 MTT法检测蛋白原液生物学活性 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 重组碱性成纤维细胞生长因子的制备及检测 |
| 4.1 构建mPLB1-bFGF-P-9与w-bFGF-RC11 工程菌 |
| 4.1.1 目的基因的表达设计 |
| 4.1.2 目的基因的重组与转化 |
| 4.2 r-bFGF融合蛋白的表达 |
| 4.2.1 优化表达条件 |
| 4.2.2 发酵罐放大培养 |
| 4.3 r-bFGF融合蛋白的分离纯化 |
| 4.4 r-bFGF蛋白原液的特异性鉴定与活性检测 |
| 4.4.1 Western Blot鉴定 |
| 4.4.2 MTT法检测蛋白原液生物学活性 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）复合益生菌及板蓝根多糖对断奶仔猪生长性能和免疫功能的影响研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 板蓝根多糖 |
| 1.1.1 板蓝根多糖的生物活性研究 |
| 1.1.2 板蓝根多糖在养殖业的临床应用 |
| 1.2 益生菌 |
| 1.2.1 益生菌的作用 |
| 1.2.2 益生菌制剂在养殖业的应用 |
| 1.2.3 益生菌发展优势与趋势 |
| 1.3 益生菌、多糖组合作用研究进展 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验复合益生菌 |
| 2.1.2 试验动物和设计 |
| 2.1.3 试验日粮 |
| 2.1.4 试验动物的饲养与管理 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 仔猪生长性能和免疫功能的测定指标 |
| 2.2.1 断奶仔猪生长性能测定指标 |
| 2.2.2 断奶仔猪免疫水平测定指标 |
| 2.2.3 断奶仔猪粪便菌群及腹泻情况测定指标 |
| 2.2.4 断奶仔猪消化功能测定指标 |
| 2.2.4.1 样品采集和制备 |
| 2.2.4.2 指标测定和方法 |
| 2.2.5 数据统计与分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 复合益生菌和板蓝根多糖对断奶仔猪生长性能的影响 |
| 3.2 复合益生菌和板蓝根多糖对断奶仔猪免疫水平的影响 |
| 3.2.1 断奶仔猪血清生化指标 |
| 3.2.2 断奶仔猪血清免疫指标 |
| 3.3 复合益生菌和板蓝根多糖对断奶仔猪粪便菌群及腹泻情况的影响 |
| 3.3.1 断奶仔猪粪便菌群情况 |
| 3.3.2 断奶仔猪腹泻情况 |
| 3.4 复合益生菌和板蓝根多糖对断奶仔猪消化功能的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 复合益生菌和板蓝根多糖对断奶仔猪生长性能的影响 |
| 4.2 复合益生菌和板蓝根多糖对断奶仔猪免疫水平的影响 |
| 4.2.1 对血清中生化指标的影响 |
| 4.2.2 对血清免疫指标的影响 |
| 4.3 复合益生菌和板蓝根多糖对断奶仔猪粪便菌群及腹泻情况的影响 |
| 4.3.1 对肠道微生物菌群的影响 |
| 4.3.2 对仔猪腹泻率的影响 |
| 4.4 复合益生菌和板蓝根多糖对断奶仔猪消化功能的影响 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）酿酒酵母甘露聚糖对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1表达影响及其信号通路研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 AMPs |
| 1.1.1 AMPs简介 |
| 1.1.2 AMPs分类 |
| 1.1.3 防御素的生物学活性 |
| 1.1.4 绵羊β-防御素(SBD)的研究进展 |
| 1.2 益生菌 |
| 1.2.1 益生菌的定义和作用机制 |
| 1.2.2 益生菌的分类 |
| 1.2.3 酿酒酵母菌 |
| 1.2.4 酿酒酵母菌细胞壁 |
| 1.2.5 甘露聚糖 |
| 1.3 识别真菌的模式识别受体 |
| 1.3.1 CLRs |
| 1.3.2 TLRs |
| 1.4 识别甘露聚糖的受体 |
| 1.4.1 Dectin-2 |
| 1.4.2 TLR-2 |
| 1.5 MAPK信号通路 |
| 1.5.1 ERK1/2通路 |
| 1.5.2 JNK通路 |
| 1.5.3 p38通路 |
| 1.5.4 其他MAPK通路 |
| 1.6 NF-κB信号通路 |
| 1.6.1 经典NF-κB信号通路 |
| 1.6.2 非经典NF-κB信号通路 |
| 1.7 研究目的及意义 |
| 1.8 研究内容 |
| 1.8.1 ORECs的体外分离培养、冻存及复苏方法研究 |
| 1.8.2 甘露聚糖对ORECs SBD-1表达的影响 |
| 1.8.3 甘露聚糖诱导ORECs SBD-1表达的信号通路研究 |
| 2 试验一 ORECs的体外分离培养、冻存及复苏方法研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 主要仪器与试剂耗材 |
| 2.1.3 主要试剂的配制方法 |
| 2.1.4 试验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 绵羊瘤胃组织胰蛋白酶消化结果 |
| 2.2.2 ORECs的原代培养结果 |
| 2.2.3 ORECs的纯化及传代培养结果 |
| 2.2.4 ORECs的鉴定结果 |
| 2.2.5 不同体积配方冻存液对ORECs冷冻保护效果的影响 |
| 2.2.6 复苏后ORECs生物学活性检测结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 3 试验二 甘露聚糖对ORECs SBD-1 mRNA及蛋白表达的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 主要仪器与试剂耗材 |
| 3.1.3 主要试剂的配制方法 |
| 3.1.4 试验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 传代细胞培养结果 |
| 3.2.2 qPCR扩增产物的特异性检测结果 |
| 3.2.3 甘露聚糖刺激ORECs对SBD-1表达的影响 |
| 3.2.4 甘露聚糖刺激ORECs后对细胞活力的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 4 试验三 甘露聚糖诱导ORECs SBD-1表达的信号通路研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 主要仪器与试剂耗材 |
| 4.1.3 主要试剂的配制方法 |
| 4.1.4 试验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 Dectin-2在ORECs内的表达检测结果 |
| 4.2.2 甘露聚糖刺激ORECs后对Dectin-2和TLR-2表达的影响 |
| 4.2.3 Dectin-2和TLR-2在甘露聚糖诱导SBD-1表达过程中的作用 |
| 4.2.4 Syk在ORECs内的表达检测结果 |
| 4.2.5 甘露聚糖可以激活Syk |
| 4.2.6 Syk在甘露聚糖诱导SBD-1表达过程中的作用 |
| 4.2.7 甘露聚糖通过Dectin-2激活Syk |
| 4.2.8 甘露聚糖通过Syk激活MAPK和NF-kB信号通路 |
| 4.2.9 甘露聚糖刺激ORECs不同时间对MAPK和NF-kB信号通路中各因子磷酸化水平的影响 |
| 4.2.10 MAPK和NF-kB信号通路在甘露聚糖诱导SBD-1表达过程中的作用 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 5 结论 |
| 6 创新性 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（7）鸡表皮生长因子在乳酸乳球菌中的表达及初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 EGF在体内的分布 |
| 1.2 EGF的作用机制 |
| 1.3 EGF的生理功能及其应用 |
| 1.3.1 EGF的生理功能 |
| 1.3.1.1 EGF在胃肠组织中的作用 |
| 1.3.1.2 EGF在肝组织中的作用 |
| 1.3.1.3 EGF在肾组织中的作用 |
| 1.3.1.4 EGF在其他器官组织中的作用 |
| 1.3.1.5 EGF在生殖系统中的作用 |
| 1.3.1.6 EGF在肿瘤中的作用 |
| 1.3.2 EGF的应用 |
| 1.4 EGF的制备 |
| 1.4.1 EGF在大肠杆菌表达系统中的表达 |
| 1.4.2 EGF在酵母表达系统中的表达 |
| 1.4.3 EGF在芽孢杆菌及乳酸菌表达系统中的表达 |
| 1.4.4 EGF在其他系统中的表达 |
| 1.5 乳酸菌表达系统 |
| 1.5.1 NICE系统的调控机制 |
| 1.5.2 NICE系统的应用 |
| 2 研究目的和意义 |
| 3 材料和方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 载体与菌株 |
| 3.1.2 动物细胞 |
| 3.1.3 主要试剂及化学药品 |
| 3.1.4 主要溶液及培养基的制备 |
| 3.1.5 主要仪器与设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 pNZ8149-gEGF重组质粒的构建 |
| 3.2.1.1 gEGF基因的获取 |
| 3.2.1.2 引物设计和合成 |
| 3.2.1.3 gEGF的扩增与PCR产物的纯化 |
| 3.2.1.4 质粒pNZ8149 的提取 |
| 3.2.1.5 目的基因及载体的酶切与回收 |
| 3.2.1.6 目的基因与载体的连接 |
| 3.2.1.7 乳酸菌感受态的制备 |
| 3.2.1.8 转化 |
| 3.2.1.9 转化子的验证 |
| 3.2.2 gEGF的诱导表达及鉴定 |
| 3.2.2.1 gEGF的诱导表达 |
| 3.2.2.2 表达产物的Western blot检测 |
| 3.2.2.3 LL-pNZ8149-gEGF上清蛋白的浓缩 |
| 3.2.2.4 上清蛋白纯化 |
| 3.2.2.5 Tricine-SDS-PAGE检测纯化产物 |
| 3.2.2.6 Western blot检测纯化产物 |
| 3.2.2.7 质谱鉴定检测纯化产物 |
| 3.2.2.8 gEGF蛋白浓度的测定 |
| 3.2.3 gEGF的体外活性鉴定 |
| 3.2.3.1 鸡胚成纤维细胞UMNSAH/DF-1 的复苏 |
| 3.2.3.2 UMNSAH/DF-1 的传代培养 |
| 3.2.3.3 UMNSAH/DF-1 的冻存 |
| 3.2.3.4 蛋白体外活性的鉴定 |
| 3.2.4 gEGF对肉鸡生长性能、免疫功能及肠道发育的影响 |
| 3.2.4.1 动物试验设计 |
| 3.2.4.2 EGF对肉鸡生长性能的影响 |
| 3.2.4.3 EGF对免疫功能的影响 |
| 3.2.4.4 EGF对肠道发育的影响 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 pNZ8149-gEGF重组质粒的构建 |
| 4.1.1 gEGF的扩增结果 |
| 4.1.2 重组质粒pNZ8149-gEGF电转化结果 |
| 4.1.3 转化子的鉴定结果 |
| 4.2 gEGF的诱导表达及鉴定结果 |
| 4.2.1 表达产物的western blot分析结果 |
| 4.2.2 不同浓度Nisin诱导及不同诱导时间上清中g EGF表达检测结果 |
| 4.2.3 纯化蛋白的鉴定结果 |
| 4.2.4 纯化蛋白的质谱鉴定 |
| 4.2.5 蛋白表达量的测定结果 |
| 4.3 gEGF的体外活性鉴定结果 |
| 4.4 gEGF对肉鸡生长性能、免疫功能及肠道发育的影响 |
| 4.4.1 gEGF对肉鸡生长性能的影响 |
| 4.4.2 gEGF对肉鸡免疫功能的影响 |
| 4.4.3 gEGF对肉鸡肠道发育的影响 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（8）鲫鱼TGFβ1基因的克隆及蛋白功能初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 TGFβ结构 |
| 1.2 TGFβ生物学功能 |
| 1.2.1 TGFβ在生长发育与增殖分化中的作用 |
| 1.2.2 TGFβ在免疫功能中的作用 |
| 1.2.3 TGFβ在肿瘤中的作用 |
| 1.2.4 TGFβ在肝纤维化中的作用 |
| 1.3 TGFβ信号通路 |
| 第2章 鲫鱼TGFβ1 基因的克隆及生物信息学分析 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 试验仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 引物设计与合成 |
| 2.2.2 RNA的提取与模板制备 |
| 2.2.3 PCR扩增 |
| 2.2.4 目的基因克隆 |
| 2.2.5 蛋白质结构预测 |
| 2.2.6 系统进化树构建 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 目的基因扩增 |
| 2.3.2 TGFβ1 核酸序列分析 |
| 2.3.3 TGFβ1 信号肽和跨膜分析 |
| 2.3.4 TGFβ1 二级结构与三级结构预测 |
| 2.3.5 TGFβ1 结构域分析 |
| 2.3.6 TGFβ1 系统进化树 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 TGFβ1 结构分析 |
| 2.4.2 TGFβ1 系统进化树分析 |
| 第3章 鲫鱼TGFβ1 基因对益生菌的应答 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 试验动物 |
| 3.1.2 试验菌株 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 动物试验 |
| 3.2.2 引物设计 |
| 3.2.3 RNA提取及c DNA合成 |
| 3.2.4 TGFβ1 基因表达分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 标准曲线的建立 |
| 3.3.2 TGFβ1 基因对复合益生菌的应答 |
| 3.3.3 TGFβ1 基因在不同时间的表达差异 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 TGFβ1 基因对复合益生菌的应答 |
| 3.4.2 TGFβ1 基因不同时间的表达差异 |
| 第4章 鲫鱼TGFβ1 信号通路基因对益生菌的应答 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 试验动物 |
| 4.1.2 试验菌株 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 动物试验 |
| 4.2.2 引物设计 |
| 4.2.3 RNA提取及c DNA合成 |
| 4.2.4 TGFβ1 基因下游通路基因表达 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 标准曲线的建立 |
| 4.3.2 TGFβ1 基因下游通路基因的表达 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 TGFβ1 非经典信号通路 |
| 4.4.2 TGFβ1 经典信号通路 |
| 第5章 鲫鱼TGFβ1 蛋白表达及鉴定 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 试验仪器 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 引物设计 |
| 5.2.2 表达载体的构建 |
| 5.2.3 重组质粒的筛选鉴定及诱导表达 |
| 5.2.4 目的蛋白纯化 |
| 5.2.5 目的蛋白定量 |
| 5.2.6 质谱鉴定 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 重组子的鉴定 |
| 5.3.2 TGFβ1 原核表达 |
| 5.3.3 TGFβ1 蛋白纯化 |
| 5.3.4 TGFβ1 蛋白定量 |
| 5.3.5 TGFβ1 蛋白鉴定 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 原核表达载体的选择 |
| 5.4.2 TGFβ1 原核表达及鉴定 |
| 第6章 TGFβ1 蛋白对鲫鱼血清指标和免疫基因的影响 |
| 6.1 试验材料 |
| 6.1.1 试验动物 |
| 6.1.2 试验仪器 |
| 6.1.3 主要试剂 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.2.1 动物饲养 |
| 6.2.2 引物设计 |
| 6.2.3 血清学指标检测 |
| 6.2.4 免疫基因检测 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 鲫鱼血清学指标的变化 |
| 6.3.2 鲫鱼免疫基因的变化 |
| 6.4 讨论 |
| 6.4.1 TGFβ1 蛋白对鲫鱼血清学指标的影响 |
| 6.4.2 TGFβ1 蛋白对鲫鱼免疫基因的影响 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 研究生期间学术成果 |
| 致谢 |
（9）芽孢杆菌表达系统的特点及研究进展（论文提纲范文）
| 1 构建高效表达的芽孢杆菌表达体系 |
| 1.1 提高质粒的稳定性 |
| 1.2 表达调控元件的选择 |
| 1.3 提高表达效率 |
| 2 芽孢杆菌表达系统的应用现状 |
| 2.1 B.subtilis芽孢杆菌表达系统的应用 |
| 2.2 其他芽孢杆菌表达系统的应用 |
| 3 芽孢杆菌表达系统的特点及发展前景 |
（10）复合益生菌对罗非鱼免疫相关基因的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 益生菌及其研究现状 |
| 1.1.1 益生菌的定义 |
| 1.1.2 益生菌的种类 |
| 1.1.3 益生菌的作用机制 |
| 1.1.4 益生菌在水产方面的应用研究 |
| 1.2 COX-2的研究现状 |
| 1.2.1 COX-2的概况 |
| 1.2.2 COX-2的结构 |
| 1.2.3 COX-2的表达 |
| 1.2.4 COX-2的功能 |
| 1.2.5 COX-2在鱼类中的研究现状 |
| 1.3 IL-1β的研究现状 |
| 1.3.1 IL-1β的概况 |
| 1.3.2 IL-1β的结构 |
| 1.3.3 IL-1β表达 |
| 1.3.4 IL-1β的功能 |
| 1.3.5 IL-1β在鱼类中的研究现状 |
| 1.4 TNF-a的研究现状 |
| 1.4.1 TNF-a的概况 |
| 1.4.2 TNF-a的结构 |
| 1.4.3 TNF-a的表达 |
| 1.4.4 TNF-a的功能 |
| 1.4.5 TNF-a在鱼类中的研究现状 |
| 1.5 COX-2、IL-1β、TNF-a三因子之间的相互联系 |
| 1.6 研究目的和意义 |
| 第2章 复合益生菌对罗非鱼COX-2、IL-1β及TNF-a基因相对表达量的影响 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 益生菌 |
| 2.1.2 试验鱼 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 主要试剂和药品 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 复合益生菌的配制 |
| 2.2.2 试验饲料的制备 |
| 2.2.3 试验设计 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 DNA的PCR扩增结果 |
| 2.3.2 real-time Q-PCR数据有效性分析结果 |
| 2.3.3 复合益生菌对罗非鱼中COX-2基因相对表达量的影响 |
| 2.3.4 复合益生菌对罗非鱼中IL-1β基因相对表达量的影响 |
| 2.3.5 复合益生菌对罗非鱼中TNF-a基因相对表达量的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 复合益生菌对罗非鱼COX-2基因相对表达量的影响 |
| 2.4.2 复合益生菌对罗非鱼IL-1β基因相对表达量的影响 |
| 2.4.3 复合益生菌对罗非鱼TNF-a基因相对表达量的影响 |
| 第3章 复合益生菌对罗非鱼抗感染保护率的影响 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 益生菌 |
| 3.1.2 试验鱼 |
| 3.1.3 主要仪器设备和耗材 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 试验鱼攻毒死亡情况 |
| 3.3.2 对罗非鱼免疫保护率的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、碱性成纤维细胞因子在枯草芽孢杆菌BS224中的表达（论文参考文献）
- [1]功能角蛋白制备用酶在Bacillus subtilis中的高效表达与改造[D]. 苏畅. 江南大学, 2021(01)
- [2]枯草芽孢杆菌对肉鸡肠道黏膜屏障与TLR通路的影响及机制研究[D]. 张祥胤. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [3]鼠IFN-γ和IL-10细胞因子的表达及单克隆抗体的制备[D]. 姜涛. 华中农业大学, 2020(02)
- [4]重组人EGF、bFGF的高效可溶性表达研究及活性检测[D]. 李鑫. 河北科技大学, 2020(01)
- [5]复合益生菌及板蓝根多糖对断奶仔猪生长性能和免疫功能的影响研究[D]. 廖海洪. 广西大学, 2019(02)
- [6]酿酒酵母甘露聚糖对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1表达影响及其信号通路研究[D]. 金鑫. 内蒙古农业大学, 2019
- [7]鸡表皮生长因子在乳酸乳球菌中的表达及初步应用[D]. 周宇. 华中农业大学, 2019(02)
- [8]鲫鱼TGFβ1基因的克隆及蛋白功能初探[D]. 李晨阳. 西南民族大学, 2019(03)
- [9]芽孢杆菌表达系统的特点及研究进展[J]. 苗苗,黄昆仑,梁志宏. 食品工业科技, 2017(18)
- [10]复合益生菌对罗非鱼免疫相关基因的影响[D]. 杨虎城. 湖南农业大学, 2015(02)