小麦中3个水分胁迫相关基因的克隆与表达

论文摘要

干旱是影响植物生长发育最重要的逆境因子。本文在前期分析小麦品种‘洛旱2号’水分胁迫后根系基因差异表达谱的基础上,克隆了3个水分胁迫反应相关基因,分析了克隆基因在干旱、高盐（NaCL）胁迫和ABA处理条件下的表达特性。主要结果如下:1.利用RT-PCR结合RACE技术,从抗旱小麦品种‘洛旱2号’中克隆了1个编码富含亮氨酸的核糖核酸抑制蛋白的cDNA全长,命名为TaLRR1。序列分析显示, TaLRR1的cDNA全长为2 657 bp,其中5′-非翻译区47 bp,3′-非翻译区1 314 bp,开放阅读框1 296 bp,可编码431个氨基酸,分子量为45.79 KD。蛋白质结构特性分析显示,TaLRR1基因编码的蛋白具有典型的富含亮氨酸N-末端保守域和富含亮氨酸核酸酶抑制剂保守域,该蛋白为弱酸性蛋白,等电点为5.69,无明显的疏水/亲水区域。三维结构预测显示,TaLRR1蛋白以α-螺旋、β-折叠和无规卷曲为骨架,可形成弧状的螺线管结构以及一对侧臂凸起。2.利用RT-PCR技术克隆了编码脱水素的1个部分cDNA序列和1个包含完整3′端的cDNA,分别命名为TaDHD1和TaDHD2。序列分析显示:TaDHD1基因cDNA片段长度为689bp,推测可编码185个氨基酸,该蛋白的分子量为18.91kD;TaDHD2基因cDNA片段长度为619bp。聚类分析表明,TaDHD1与小麦TaWZY1-1亲源关系最近,TaDHD2基因与小麦TaWZY1-2、拟南芥CAA62449、CAA54705、CAA62448同源关系较近,为两个在小麦中新克隆的编码脱水素的基因。3.以抗旱品种‘洛旱2号’和对照品种‘中国春’为材料,利用半定量RT-PCR分析了3个克隆基因在干旱、高盐（NaCl）胁迫及ABA处理条件下的表达特性。结果表明,TaLRR1基因在‘洛旱2号’中受干旱、盐胁迫诱导表达,在‘中国春’中只受干旱胁迫诱导表达;两个品种中TaLRR1均不受ABA诱导表达,说明TaLRR1为干旱胁迫诱导但不受ABA调控表达的基因;TaDHD1基因在‘洛旱2号’中受干旱、盐胁迫和ABA诱导表达,而在‘中国春’中不受干旱、盐胁迫和ABA诱导表达,推测TaDHD1可能与‘洛旱2号’具有较强的抗旱性有关;TaDHD2基因在两个品种中均受干旱、盐胁迫和ABA诱导表达,表明TaDHD2为受ABA调控且与抗旱、耐盐有关的基因。研究结果为进一步探讨‘洛旱2号’抗旱机制以及小麦抗旱分子育种奠定基础。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 植物对水分胁迫的生理调节机制
• 1.1.1 水分胁迫与植物代谢
• 1.1.2 水分胁迫与气孔运动
• 1.1.3 水分胁迫与渗透调节
• 1.1.4 水分胁迫与抗氧化防御系统
• 1.2 植物对水分胁迫的分子调节机制
• 1.2.1 植物细胞水分胁迫信号的感知
• 1.2.2 植物细胞水分胁迫信号的传导
• 1.2.3 水分胁迫诱导的基因表达及转录调控
• 1.3 含LRR 的核糖核酸抑制因子研究概述
• 1.3.1 核糖核酸酶抑制因子的存在与氨基酸组成
• 1.3.2 核糖核酸酶抑制因子的结构
• 1.3.3 核糖核酸酶抑制因子与核糖核酸酶的结合
• 1.4 类脱水素蛋白研究概述
• 1.4.1 脱水素的结构和分类
• 1.4.2 脱水素的亚细胞定位及在细胞中的转运
• 1.4.3 脱水素基因的表达与调控
• 1.4.4 脱水素的功能与作用机理
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 植物材料和菌株
• 3.1.2 质粒载体
• 3.1.3 工具酶及试剂盒
• 3.1.4 主要仪器
• 3.1.5 PCR 引物
• 3.1.6 LB 培养基
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 总RNA 提取、质量鉴定及纯化
• 3.2.1.1 试验前的准备
• 3.2.1.2 总RNA 提取操作步骤
• 3.2.1.3 总RNA 质量及浓度测定
• 3.2.1.4 总RNA 的纯化
• 3.2.2 目的基因的克隆
• 3.2.2.1 反转录
• 3.2.2.2 内标基因Actin 循环数的确定
• 3.2.2.3 克隆基因表达特性分析及模板量的确定
• 3.2.2.4 克隆基因表达特性分析
• 3.2.3 3’RACE 实验步骤
• 3.2.3.1 反转录反应
• 3.2.3.2 套式PCR 反应
• 3.2.3.3 琼脂糖凝胶电泳
• 3.2.3.4 测序分析
• 3.2.4 5’RACE 实验方案
• 3.2.4.1 去磷酸化处理
• 3.2.4.2 “去帽子”反应
• 3.2.4.3 5′RACE Adaptor的连接
• 3.2.4.4 反转录反应
• 3.2.4.5 Outer PCR 反应
• 3.2.4.6 Inner PCR反应
• 3.2.4.7 琼脂糖凝胶电泳
• 3.2.4.8 测序分析
• 4 结果和分析
• 4.1 小麦水分胁迫相关基因的克隆
• 4.1.1 RNA质量检测及第一链的获得
• 4.1.2 TaLRR1的克隆及序列分析
• 4.1.2.1 小麦TaLRR1 全长cDNA 的克隆和序列分析
• 4.1.2.2 小麦TaLRR1 编码蛋白质的一级结构特性分析
• 4.1.2.3 小麦TaLRR1 编码蛋白质的高级结构特性分析
• 4.1.3 DHD 相关基因的克隆及序列分析
• 4.1.3.1 TaDHD1 基因的克隆与序列分析
• 4.1.3.2 TaDHD2基因的克隆及序列分析
• 4.1.3.3 DHD 与其它物种的基因类比分析
• 4.2 克隆基因的表达特性分析
• 4.2.1 胁迫不同时期及其对照总RNA 的提取
• 4.2.2 TaLRR1 基因在不同胁迫条件下的表达特性分析
• 4.2.2.1 TaLRR1 基因在20% PEG6000 处理的小麦洛旱2 号和中国春中的表达分析
• 4.2.2.2 TaLRR1基因在100uM ABA处理的小麦洛旱2号和中国春中的表达分析
• 4.2.2.3 TaLRR1基因在150uMNaCl处理后小麦洛旱2号和中国春中的表达分析
• 4.2.3 TaDHD1 基因在不同胁迫条件下的表达特性分析
• 4.2.3.1 TaDHD1 基因在20% PEG6000 处理的小麦洛旱2 号和中国春中的表达分析
• 4.2.3.2 TaDHD1 基因在 100uMABA 处理的小麦洛旱 2 号和中国春中的表达分析
• 4.2.3.3 TaDHD1 基因在 150uMNaCl 处理后小麦洛旱 2 号和中国春中的表达分析
• 4.2.4 TaDHD2 基因在不同胁迫条件下的表达特性分析
• 4.2.4.1 TaDHD2 基因在20% PEG6000 处理的小麦洛旱2 号和中国春中的表达分析
• 4.2.4.2 TaDHD2 基因在 100uMABA 处理的小麦洛旱 2 号和中国春中的表达分析
• 4.2.4.3 TaDHD2 基因在 150uMNaCl 处理后小麦洛旱 2 号和中国春中的表达分析
• 5 讨论
• 5.1 TaLRR1在小麦水分胁迫中生物学功能探讨
• 5.2 TaDHD1和TaDHD2在小麦水分胁迫中生物学探讨
• 参考文献
• ABSTRACT