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棕点湍蛙抗菌肽Cathelicidin-AL的分离纯化、基因克隆及抗菌活力分析

2020-12-11阅读(317)

棕点湍蛙抗菌肽Cathelicidin-AL的分离纯化、基因克隆及抗菌活力分析

论文摘要

Cathelicidins作为抗菌肽两大家族之一,在大多数脊椎动物的天然防御系统中发挥着中心作用。以前仅在哺乳类、鸟类、爬行类和鱼类中有发现,而本次在棕点湍蛙体中发现的Cathelicidin-AL也是世界上首次在两栖类体中发现的cathelicidins家族抗菌肽,这一重大发现填补了cathelicidins抗菌肽家族进化史的缺口。研究表明,cathelicidins不仅具有广谱的抗微生物活性,还具有许多其他生物学活性,如对多种免疫细胞具有趋化作用、诱导肥大细胞脱粒和组织胺释放、诱导血管发生、促进伤口愈合、诱导淋巴细胞活化和变异细胞系细胞凋亡等。在本论文中,我们对棕点湍蛙体内cathelicidins抗菌肽家族cathelicidin-AL进行了一些初步的研究。我们通过凝胶过滤和反相高压液相色谱层析的方法从棕点湍蛙皮肤分泌液中分离纯化得到棕点湍蛙cathelicidins家族抗菌肽,命名为cathelicidin-AL.Edman降解法测定其氨基酸序列为RRSRRGRGGGRRGGSGGRGGRGGGGRSGAGSSIAGVGSR GGGGGRHYA,由48个氨基酸残基组成,MALDI-TOF-MS测得其分子量为4453.286Da。构建了棕点湍蛙皮肤cDNA文库,从中克隆得到了编码cathelicidin-AL前体的cDNA序列。该cDNA序列长度为660bp,由此推断出的cathelicidin-AL前体由179个氨基酸残基组成,包括信号肽区、保守的cathelin区和成熟肽区三部分。用RT-PCR的方法对cathelicidin-AL的组织表达情况进行了研究,结果表明cathelicidin-AL在棕点湍蛙的胃、皮肤、肌肉、心脏、肾脏、肺、肠、脾脏、肝脏、胆中均有表达,其中在皮肤中只能看到微量表达,而在脑中没有看到表达。进化分析表明,棕点湍蛙cathelicidin-AL同爬行类及哺乳类的cathelicidins亲缘性要比鱼类更近些。同时我们也期待能有更多其他两栖类cathelicidins抗菌肽的发现来补充这个进化数据。对cathelicidin-AL的杀菌活力进行了研究。Cathelicidin-AL具有广谱的抗微生物活性,尤其是对金黄色葡萄球菌的两株标准菌株以及绿脓假单胞菌的一株标准菌株具有很强的杀伤力。透射电镜结果表明,经过cathelicidin-AL处理的细菌细胞形态发生了明显的改变,细胞壁和细胞膜之间的界面模糊,细胞表面出现了大量囊泡状结构,因此推测cathelicidin-AL是通过破坏细菌的细胞壁和细胞膜达到杀菌效用的。此外,cathelicidin-AL的溶血活性和细胞毒性均不明显,这为它作为潜在的抗菌药物提供了参考依据。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 文献综述
  • 一.Cathelicidins抗菌肽研究进展
  • 1. Cathelicidins抗菌肽的基因组成和结构
  • 2. Cathelicidins抗菌肽的分类以及表达分布
  • 3. Cathelicidins的活性与功能
  • 4. 研究展望
  • 参考文献
  • 第二章 棕点湍蛙cathelicidin-AL抗菌肽的分离纯化以及功能研究
  • 一.前言
  • 二.材料与方法
  • 1. 实验材料
  • 2. 棕点湍蛙的处理和样品收集方法
  • 3. 分离纯化
  • 4. 一级结构分析
  • 5. 抗菌活性的检测
  • 6. 投射电子显微镜观察
  • 7. 溶血活性的检测
  • 8. 细胞毒性的检测
  • 三.结果与讨论
  • 四.本章小结
  • 第三章 棕点湍蛙cathelicidin-AL抗菌肽的基因克隆、序列分析及组织表达研究
  • 一.前言
  • 二.材料与方法
  • 1. 实验材料
  • 2. 棕点湍蛙皮肤cDNA文库的构建
  • 3. 分子克隆
  • 4. Cathelicidin-AL在各组织中的转录水平
  • 5. 序列、进化分析
  • 三.结果与讨论
  • 四.本章小结
  • 总结
  • 参考文献
  • 攻读学位期间发表论文目录
  • 获奖情况
  • 致谢

    • 相关论文文献

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