点突变的鸡Ii基因和Ii-新城疫病毒融合基因表达特性研究

论文摘要

Ii链是一种非多态性的Ⅱ型跨膜蛋白，其中一个重要功能是确保新合成的MHCⅡ分子的胞内转运。MHCⅡ-Ii复合体的内体分选信号已被证明为Ii链胞浆尾部的两个独立的亮氨酸基元，即Leu7/Ile8和Pro15/Met16/Leu17。鸡Ii链胞浆尾部含有Leu8/Ile9和Val17/Leu18两个基元，但基元周围氨基酸是否对内体定位功能发挥作用还未见报道。我们利用大引物PCR定点突变法，将鸡Ii链胞浆尾部两个基元及其基元周围氨基酸分别突变为丙氨酸（Ala），然后连接到pEGFP-C1载体中，构建一系列突变体。利用脂质体LipofectamineTM2000介导的转染方法，将突变体转染到COS-7细胞，荧光显微镜下观察GFP-Ii融合蛋白的定位情况。结果显示，两个基元可以独立调控Ii分子的内化；突变Glu3、Glu4、Gln5、Ile9、Ser10、Ser15、Gly16、Val17或Pro19时，融合蛋白均定位于细胞浆，Ii分子内化功能丧失；而突变Arg6、Asp7、Ser11、Asp12、G1y13或Ser14时，融合蛋白均定位于细胞内体，Ii分子内化功能保持。结果表明，鸡Ii链胞浆尾部两个亮氨基酸基元具有独立地内体定位信号功能，同时，两个基元功能的正确发挥需要周围氨基酸特定的空间结构支持。各类动物Ii链的跨膜区是进化中最保守的部分。研究发现，跨膜区在Ii分子自身聚合成三聚体中发挥重要的作用，在缺乏胞外区的情况下，跨膜区可以使Ii有效聚合成三聚体状态。已证实人Ii链跨膜区Gln47，Thr49和Thr50三个氨基酸对MHCII-Ii复合物的形成是必须的。我们应用大引物PCR突变法，将鸡Ii基因的Gln47和Thr50氨基酸突变，构建了C1-Q47A和C1-T50A重组质粒。同时，MHCⅡ分子的α链和β链被亚克隆到pEGFP-N1载体，构建了GFP-α、GFP-β重组质粒。我们将C1-Q47A或C1-T50A和GFP-α、GFP-β共转染COS-7细胞，利用Western blot和免疫共沉淀对鸡Ii链跨膜的功能进行初步探讨。结果表明，突变Ii链跨膜区Gln47或Thr50氨基酸后，MHCⅡ-Ii复合物的形成受限。Ii链可以应用于构建Ii-抗原表位嵌合体。一些研究者用Ii链序列作为基本的框架，将CLIP区用CD4+T细胞抗原表位基因序列替代，将该嵌合基因插入真核表达载体，构建的嵌合体中的抗原表位能够有效地呈递给T细胞。关于鸡Ii分子CLIP替代的DNA疫苗目前没有研究报道，我们利用3轮重叠PCR将鸡Ii基因的CLIP区去除，此时恰好形成了一个HindⅢ酶切位点，再通过常规PCR扩增NDV的F343抗原表位基因，该基因片段长33个氨基酸，两段带有HindⅢ酶切位点。将F343基因通过单酶切连接入Ii分子内，构建了C1-Ii-F343内源性靶向抗原表位嵌合体DNA疫苗。同时，构建了C1-F343非靶向DNA疫苗作为对照。30只6-8周龄的雌性BALB/c小鼠随机分为5组，用内源性靶向DNA疫苗（C1-Ii-F343）和非靶向DNA疫苗（C1-F343）于股四头肌进行免疫,生理盐水、C1和C1-△CLIP作为研究对照。经过3次免疫后，取外周血对小鼠的体液免疫进行检测，免疫结果显示，只有C1-Ii-F343和C1-F343免疫组小鼠可以检测到针对F343抗原的特异性抗体，抗体滴度分别达到6400和1600，内源性靶向DNA疫苗组明显高于非靶向DNA疫苗组。构建抗原表位DNA替换鸡Ii分子的CLIP片段基因疫苗，为NDV的双靶向疫苗奠定实验基础。

论文目录

• 中文摘要
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• 图表目录
• 缩略词表
• 文献综述
• 1 Ii链的研究概况
• 1.1 Ii链的分子结构
• 1.2 Ii链 的表达与调控
• 1.3 Ii链的功能
• 1.3.1 Ii链在MHCⅡ分子抗原提呈中的作用
• 1.3.2 Ii链胞浆尾部信号调控MHC-Ⅱ-Ii复合物的分选/内化
• 1.4 Ii链与疾病的关系
• 2 新城疫病毒的研究概况
• 2.1 NDV分子生物学特征
• 2.2 NDV的至病性及其分子基础
• 2.3 NDV的抗原性与基因型
• 2.4 ND的分子流行病学研究及防制
• 2.5 F蛋白的研究
• 2.5.1 F蛋白的基本结构
• 2.5.2 F蛋白的抗原表位
• 2.5.3 F蛋白基因工程疫苗研究现状
• 2.5.4 F蛋白表位疫苗的开发和应用
• 3 国内外研究现状
• 4 研究的目的与意义
• 引言
• 正文
• 第一章 Ii链胞浆区定点突变及其定位检测
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 鸡Ii链胞浆区氨基酸定点突变
• 1.2.2 截短的野生型Ii（1-83aa）真核表达载体构建
• 1.2.3 突变Ii基因的定位检测
• 2 结果与分析
• 2.1 胞浆区基因突变
• 2.2 两个亮氨酸是鸡Ii链细胞内定位所必须的
• 2.3 两个亮氨酸邻近的特定氨基酸在鸡Ii分子细胞内定位中的作用也是必需的
• 2.4 第19位的脯氨酸可能是维持鸡Ii分子结构完整性的重要残基
• 3 讨论
• 3.1 利用大引物PCR进行高效快速定点诱变
• 3.2 定位基元周围氨基酸的作用
• 4 结论
• 第二章 鸡Ii链跨膜区氨基酸的定点突变及其功能检测
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 真核表达质粒的构建
• 1.2.2 突变载体的构建
• 2 结果与分析
• 2.1 重组质粒的构建与鉴定
• 2.2 跨膜区段基因突变
• 2.3 Ii链与MHCⅡ分子的相互作用
• 3 讨论
• 3.1 改进的大引物突变法
• 3.2 载体的选择
• 3.3 跨膜区段对形成三聚体的影响
• 4 结论
• 第三章 NDVF343抗原表位替代Ii链CLIP的内源性靶向DNA疫苗的构建及免疫应答研究
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 缺失CLIP区段的Ii基因片段真核表达质粒的构建
• 1.2.2 NDV-F343蛋白抗原表位非靶向DNA疫苗的构建
• 1.2.3 NDV-F343蛋白抗原表位替代Ii-CLIP的内源性靶向DNA疫苗构建
• 1.2.4 大量超纯质粒的制备:免疫小鼠用
• 1.2.5 NDV-F343蛋白抗原表位替代Ii-CLIP内源性靶向DNA疫苗免疫应答研究
• 2 结果与分析
• 2.1 构建缺失CLIP区段的Ii基因片段真核表达质粒
• 2.2 构建NDV-F343蛋白抗原表位非靶向DNA疫苗
• 2.3 构建NDV-F343蛋白抗原表位替代Ii链CLIP的内源性靶向DNA疫苗
• 2.4 鼠抗F343蛋白多克隆抗体效价测定
• 2.5 Westemblot分析抗体的特异性
• 3 讨论
• 3.1 重叠延伸产生特异位点突变
• 3.2 去磷酸化处理
• 3.3 Ii基因在疫苗设计中的应用
• 4 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 已发论文