论文摘要
人NDRG2基因（N-myc downstream regulated gene 2）是1999年从正常成人全脑文库中最先发现并克隆得到。其定位于14q11.2,含有16个外显子,15个内含子,mRNA全长为2,024 bp,编码含有357个氨基酸残基,分子量约40KD蛋白质。NDRG基因家族中最先被发现的是NDRG1,是在研究N-myc下游调节基因时从小鼠胚胎中发现的。现已发现的人NDRG基因家族成员有4个:NDRG1, NDRG2, NDRG3和NDRG4,它们之间具有较高的同源性,但其表达水平在组织发育阶段和分布上存在明显差异。目前对NDRG基因家族功能了解主要来源于NDRG1的研究,已发现上调NDRG1的因素有:同型半胱氨酸、细胞氧化应激反应（缺氧,Ni2+,各种还原剂）、视黄酸、p53等。综合已有文献,推测NDRG基因家族可能参与细胞生长分化,维持细胞氧化还原电势平衡,阻止肿瘤细胞恶化等。前期研究工作表明,NDRG2基因在多种组织中均有表达,而以中枢神经系统的大脑皮质、白质、神经核,唾液腺上皮细胞和骨骼肌细胞中表达最高,在多种肿瘤组织或细胞系如结肠癌、胶质瘤、白血病、淋巴瘤和腮腺癌中无表达或低表达,因此推测NDRG2基因可能是一新的抑癌基因,故研究NDRG2基因功能及其调节具有重要的理论意义及临床应用价值,而目前尚未见NDRG2基因与乳腺癌发生发展的详细报道。本研究旨在探讨NDRG2基因在乳腺癌发病机制中的作用,确定其功能,为乳腺癌的防治提供理论依据。本研究的主要发现如下:1、通过免疫组织化学、real time PCR、蛋白印迹等检测了人体乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中mRNA和NDRG2蛋白的表达,实验结果显示:乳腺癌肿瘤细胞系MCF-7, MDA-MB-231, SK-BR-3中NDRG2的表达水平与GES细胞相比明显降低p值;而Bcap-37中NDRG2的表达水平与GES细胞相比变化不大。2、利用上述方法检测了NDRG2在40例临床新鲜乳腺癌组织标本（包括浸润性导管癌20例、小叶癌12例、小叶原位癌8例）及相应癌旁组织标本中的表达水平。结果显示:NDRG2 mRNA在23例患者肿瘤组织中表达水平较相应癌旁组织低,且该表达与其病理分级呈正相关;仅有4例患者的乳腺肿瘤组织中NDRG2的mRNA表达水平高于相对应的自身肿瘤瘤旁组织;另外有13例患者两者NDRG2 mRNA的表达无差异。该结果提示NDRG2基因的表达量与细胞的增殖能力成反比。表达量高的,增殖能力弱,随着表达量的降低,增殖能力增加。3、通过双重基因组PCR技术和甲基化敏感性内切酶-PCR分析方法分别探寻了三种乳腺癌细胞系中NDRG2基因低表达的原因,实验结果显示:杂合性缺失可能是乳腺癌细胞系MCF-7中NDRG2表达降低的原因,而上游启动子区的甲基化可能是乳腺癌细胞系SKBR-3中NDRG2低表达的原因。在其它乳腺癌细胞系,如MDAMB-231中未检测到上述两种现象的存在,提示可能存在其它抑制NDRG2表达的因素。4、采用美国Novagen公司成熟的pAdTrack-CMV腺病毒表达系统成功获得了高表达NDRG2基因的高滴度重组腺病毒,所获重组腺病毒滴度为1.1×1011)pfu /ml。为下一步体外、体内实验奠定了基础。5、我们利用包装和鉴定好的重组NDRG2腺病毒转染低表达NDRG2的人乳腺癌细胞系MCF7,提高该细胞中NDRG2的表达水平,观察NDRG2表达对MCF7细胞生长的影响。相差显微镜下,pAd-NDRG2转染MCF7 48h后,部分细胞膜皱缩,而转染空质粒腺病毒的MCF7细胞形态未见明显变化;MTT检测结果表明,NDRG2表达对MCF7细胞生长具有抑制作用;进一步的细胞周期分析显示,MCF7细胞病毒转染组出现G1期阻滞（G1期捕获）,提示NDRG2通过细胞周期阻滞来抑制MCF7细胞增殖;凋亡检测实验结果显示:与未转染的MCF7细胞（1.0%）和空载体重组腺病毒感染的MCF7细胞（2.0%）相比,重组NDRG2腺病毒感染的MCF7细胞中凋亡细胞明显增多,感染48h后达12.0%,感染72h后达21.5%,该结果与DNALadder实验结果吻合。该结果提示过表达NDRG2可导致MCF7细胞出现凋亡。6、将MCF7、pAd-MCF7和pAd-NDRG2-MCF7细胞分别接种于裸鼠背部皮下,建立人乳腺癌裸鼠皮下移植瘤模型。结果显示,与接种MCF7和pAd-MCF7细胞的裸鼠相比,接种pAd-NDRG2-MCF7细胞的裸鼠肿瘤形成时间延迟,肿瘤生长缓慢,肿瘤体积及瘤重均明显减小;而且免疫组化染色显示pAd-NDRG2-MCF7组肿瘤组织NDRG2蛋白表达明显上调,而MCF7和pAd-MCF7组肿瘤组织NDRG2蛋白表达无明显差异,均呈低表达。上述结果提示腺病毒介导的NDRG2可在肿瘤组织中持续高表达,并可抑制肿瘤细胞的生长。综上所述,抑癌候选基因NDRG2在乳腺癌组织中随着肿瘤恶性程度的增加;且低表达的原因可能与杂合性缺失和上游启动子区的甲基化相关;在MCF7细胞荷瘤鼠模型中,过表达NDRG2可明显抑制肿瘤细胞的生长。该研究结果为进一步阐述NDRG2的功能奠定了基础,为进一步揭示乳腺癌的发病机制及开展基因治疗,提供了理论依据。