光合细菌代谢产物5-氨基乙酰丙酸杀线虫作用及其机理研究

论文摘要

植物寄生线虫病是多种农作物的重要病害,随着我国农业集约化生产和耕作制度的更替,其成为制约现代农业可持续发展的重要因素之一。目前生产上常用的化学杀线剂不仅毒性大、使用不方便,而且线虫抗药性也非常严重。生物防治具有对环境和人类危害小、不易产生抗药性等优点而逐渐成为线虫防治的研究热点。本研究选用光合细菌嗜酸柏拉红菌生防菌株HB-1 （Rhodoblastus acidophilus）,对该菌株及其代谢产物5-氨基乙酰丙酸（ALA）的杀线虫活性进行了研究,同时初步探讨了ALA的杀线虫机制。并从嗜酸柏拉红菌菌株中克隆了控制ALA合成的合成酶基因（ALAs）,将其进行原核表达,构建的工程菌ALAS-M15能高效表达ALAs,为利用工程菌研制开发杀线虫生防制剂打下基础。主要研究结果如下：1、测定了嗜酸柏拉红菌菌株HB-1对秀丽小杆线虫、南方根结线虫的毒力。研究结果表明,该菌株培养液对秀丽小杆线虫、根结线虫具有较强的作用活性,96h对秀丽小杆线虫和根结线虫的LC50分别为5.13mL/L和4.81 mL/L。在温室盆栽条件下研究了该菌株培养液对番茄根结线虫病的防治效果。结果表明该菌株培养液能有效抑制南方根结线虫对番茄的侵染、显著降低番茄根中根结数量,而且能显著促进番茄生长。同时,防治黄瓜根结线虫病的田间小区试验结果也表明,该菌株培养液不仅能显著减少黄瓜根围土样中线虫数量,50倍稀释液处理药效可达到71.5%,使黄瓜早期产量增加57.7%。表明该菌株在植物线虫病害防治上的巨大应用潜力。2、通过室内生测,测定了嗜酸柏拉红菌代谢产物ALA对秀丽小杆线虫、南方根结线虫J2、大豆孢囊线虫J2和松材线虫的作用活性,同时研究了ALA对南方根结线虫卵孵化率的影响。研究结果表明,ALA对多种线虫具有作用活性,杀线虫谱广。96h对南方根结线虫J2、大豆孢囊线虫J2以及松材线虫的LC50分别为162.5mg/L、188.5mg/L和442.2mg/L。同时结果显示不仅是对南方根结线虫J2具有毒杀活性,还能显著抑制线虫卵的孵化,500 mg/L处理,对卵的孵化抑制率达到70%以上。而温室盆栽试验条件下ALA对番茄根结线虫病的防治试验结果表明,ALA能抑制根结线虫对番茄的侵染,处理15d后与对照相比根内线虫种群数量少,根组织中根结数量也显著降低。400mg/L处理番茄60d后其防效达到81.7%,与对照药剂阿维菌素防效相当。研究了ALA作用效果影响因子,结果表明光照对ALA的作用活性影响较大,利用ALA处理后再进行自然光照几小时,与黑暗环境中的处理组相比差异极显著,作用效果显著提高。而pH值、温度等对其杀线虫活性影响不大。3、利用显微技术观察了ALA处理后线虫形态结构的变化,并从生理生化角度检测了ALA对线虫体内生理代谢产物的影响,从而初步阐明ALA杀线虫作用机制。光学生物显微镜下观察到线虫经ALA处理后先变得异常活跃,随后僵直死亡,内部组织脱水缢缩,与体壁分离。SEM及TEM检测显示经ALA处理后线虫体壁受到损伤,细胞结构遭到破坏,产生自噬体类似结构。生理生化代谢产物检测结果显示,ALA处理组线虫蛋白质含量比对照组降低了16.4%,特别是非水溶性蛋白含量降低了33.4%。而SOD、CAT、GSH-Px检测结果显示处理组线虫体内保护酶系活性显著提高,处理组分别是对照组的1.78、2.33和1.35倍,MDA含量是对照组的2.70倍。ALA可影响神经靶标酶一乙酰胆碱酯酶活性,低浓度下增加乙酰胆碱酯酶活性,高浓度下对其起抑制作用。500mg/L浓度ALA溶液处理线虫,乙酰胆碱酯酶活性提高17.3%。卟啉类代谢产物的检测结果显示,ALA会导致线虫体内原卟啉Ⅸ的积累,处理组比对照组提高了52.4%,锌卟啉含量也有较大的提高。从线虫形态、结构研究结果以及蛋白质含量、氧化酶类、神经靶标酶和卟啉代谢物等生理代谢产物检测结果分析,初步认为ALA对线虫的作用机制主要是：ALA使线虫体内产生了大量活性氧,所以会刺激体内保护酶系统活性增加。活性氧会引起细胞内脂质过氧化,导致MDA含量增高。而线虫体内的脂质过氧化极易引起细胞损伤、结构破坏、生物膜渗透性的改变而最终导致线虫死亡。4、利用载体介导PCR法对5-氨基乙酰丙酸合成酶基因进行了克隆与原核表达,获得了高效表达ALAs基因的工程菌菌株,并对工程菌菌株的培养条件进行优化。使工程菌发酵液中ALA含量达到5.379g/L,为目前生物合成ALA同类研究的最高水平。对工程菌发酵液进行剂型加工,研制出防治植物线虫病害工程菌粉剂粗产品。利用该产品进行了防治黄瓜根结线虫病的温室盆栽实验,实验结果表明该粉剂产品对黄瓜根结线虫病具有很好的防治效果,2g/株穴施处理,防效可达76.67%,好于对照药剂16.8%阿维菌素·三唑磷WP的防治效果。表现出在线虫生物防治上较好的应用前景。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 植物线虫与线虫的生物防治
• 1.1 植物线虫概述
• 1.2 植物线虫的发现及其病害
• 1.3 植物寄生线虫的危害
• 1.4 植物寄生线虫的防治
• 1.5 植物寄生线虫的生物防治
• 2 光合细菌及其在农业生产上的应用
• 2.1 光合细菌概述
• 2.2 光合细菌在农业生产上的应用
• 3 5-氨基乙酰丙酸（ALA）及其在农业生产上的应用
• 3.1 5-氨基乙酰丙酸概述
• 3.2 5-氨基乙酰丙酸在农业生产上的应用
• 3.3 5-氨基乙酰丙酸杀虫机理研究
• 3.4 5-氨基乙酰丙酸的生物合成
• 项目的研究与意义
• 第二章 光合细菌杀线虫作用
• 1 实验材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 嗜酸柏拉红菌PSB-O1的培养及培养液的制备
• 1.2.2 供试线虫的准备
• 1.2.3 培养液对线虫的作用活性
• 1.2.4 防治番茄根结线虫病温室盆栽实验
• 1.2.5 防治黄瓜根结线虫病田间试验
• 2 结果与分析
• 2.1 嗜酸柏拉红菌PSB-01培养液对线虫作用活性
• 2.2 培养液防治番茄根结线虫病温室盆栽实验结果
• 2.3 培养液防治黄瓜根结线虫病田间小区试验结果
• 3 小结与讨论
• 3.1 嗜酸柏拉红菌在线虫生物防治中的应用前景
• 3.2 线虫防治效果与施药时间的关系
• 3.3 嗜酸柏拉红菌杀线虫作用机理
• 第三章 5-氨基乙酰丙酸杀线虫作用
• 1 实验材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 ALA对线虫的室内生测
• 1.2.2 ALA对根结线虫卵孵化的影响
• 1.2.3 根结线虫J2对ALA的趋避性实验
• 1.2.4 其它小分子化合物对根结线虫J2的影响
• 1.2.5 影响ALA杀线虫活性的因素
• 1.2.6 ALA防治番茄根结线虫病温室盆栽实验
• 2 结果与分析
• 2.1 ALA对秀丽小杆线虫的作用效果
• 2.2 ALA对南方根结线虫J2的作用效果
• 2.3 ALA对南方根结线虫卵孵化的影响
• 2.4 ALA对大豆孢囊线虫的作用效果
• 2.5 ALA对松材线虫的作用效果
• 2.7 南方根结线虫J2对ALA的趋避性研究结果
• 2.8 其它有机小分子物质对南方根结线虫J2的影响
• 2.9 影响ALA作用活性因子
• 2.10 ALA防治番茄根结线虫病温室盆栽试验结果
• 3 小结与讨论
• 第四章 5-氨基乙酰丙酸杀线虫机理研究
• 1 实验材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 对南方根结线虫J2形态、行为影响
• 1.2.2 对南方根结线虫J2生理结构影响
• 1.2.3 对南方根结线虫J2核DNA的影响
• 1.2.4 对南方根结线虫J2蛋白质含量的影响
• 1.2.5 对南方根结线虫J2超氧化物歧化酶活性影响
• 1.2.6 对南方根结线虫J2过氧化氢酶活性影响
• 1.2.7 对南方根结线虫J2谷胱甘肽过氧化物酶活性影响
• 1.2.8 ALA对南方根结线虫J2丙二醛含量的影响
• 1.2.9 ALA对南方根结线虫J2乙酰胆碱酯酶活性的影响
• 1.2.10 ALA对南方根结线虫J2卟啉含量的影响
• 1.2.11 ALA对寄主植物CAT酶活性及丙二醛含量的影响
• 1.2.12 统计方法
• 2 结果与分析
• 2.1 南方根结线虫形态、行为的观察结果
• 2.2 南方根结线虫生理结构电镜观察结果
• 2.3 细胞核DNA检测结果
• 2.4 蛋白质检测结果
• 2.5 线虫体内保护酶系及MDA检测结果
• 2.6 ALA对线虫神经靶标酶AChE的影响
• 2.7 线虫体内卟啉含量的检测结果
• 2.8 寄主植物CAT酶活性、MDA含量测定结果
• 3 小结与讨论
• 第五章 ALA合成酶基因的克隆与杀线虫生防制剂的研制
• 1 实验材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 ALA的生物合成与ALAS基因的克隆
• 1.2.2 ALAs基因的原核表达与工程菌构建
• 1.2.3 培养条件的优化与杀线虫生防制剂的研制应用
• 1.2.4 杀线虫产品防治黄瓜根结线虫病温室盆栽实验
• 1.2.5 杀线虫生防制剂防治黄瓜根结线虫病温室盆栽实验
• 2 结果与分析
• 2.1 5-氨基乙酰丙酸合成酶基因扩增结果
• 2.2 表达载体构建与检测结果
• 2.3 ALAs的诱导表达与蛋白检测结果
• 2.4 工程菌发酵液中ALA含量测定结果
• 2.5 工程菌培养条件的优化及粉剂产品的研制
• 2.6 粉剂产品防治黄瓜根结线虫病温室盆栽试验结果
• 2.7 粉剂产品防治芹菜根结线虫病田间试验结果
• 3 小结与讨论
• 论文总结与创新点
• 1 论文总结
• 2 创新点
• 参考文献
• 附录A 论文所用重要缩写词及中文对照
• 附录B 常用缓冲液及培养基配方
• 附录C 常用生化试剂及仪器
• 致谢