论文摘要
目的:胰腺癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一,恶性程度极高,预后很差。由于早期诊断困难,胰腺癌手术切除率低,化疗、放疗亦无突破性进展。分子靶向治疗是近年研究的亮点,但在胰腺癌治疗中无令人满意的成果。Smac是一种存在于线粒体并调节细胞凋亡的蛋白,主要通过拮抗IAPs对caspases的抑制作用,参与线粒体凋亡通路和死亡受体凋亡通路,促进细胞凋亡。以往研究发现在胃癌、膀胱癌、肺癌等多系统肿瘤中,Smac高表达与肿瘤的发生、发展,肿瘤的分期、转移等密切相关,但关于Smac在胰腺癌中的作用的研究很少。本研究通过构建Smac真核表达载体,观察转染Smac基因对人胰腺癌MiaPaCa-2细胞的影响,探讨胰腺癌MiaPaCa-2细胞过表达Smac对顺铂、吉西他滨有无增敏作用及其作用机制,以期为胰腺癌的分子靶向治疗提供新依据。方法:1人胰腺癌MiaPaCa-2细胞、白血病K562细胞常规培养,MiaPaCa-2细胞采用DMEM培养基培养,K562细胞采用RPMI-1640培养基培养。2用逆转录-聚合酶链式反应（revers transcription PCR, RT-PCR）方法从白血病K562细胞中获取细胞的cDNA。3构建pEGFP-C1-Smac重组质粒:将pEGFP-C1和步骤2所获得的PCR产物用HindⅢ及BamHⅠ进行酶切,然后纯化。将纯化产物在16℃进行连接,连接3小时后将连接产物转化大肠杆菌DH5α,加入2×YT培养基800μl,孵育60分钟,卡那平皿铺板,次日挑克隆。挑选阳性克隆进行PCR鉴定,同时将扩增后产物纯化,送检测序。4质粒的提取:用质粒小抽试剂盒从过夜培养的转化DH5α中提取重组质粒DNA。5 pEGFP-C1-Smac重组质粒转染MiaPaCa-2细胞:将MiaPaCa-2细胞分为3组,命名为未转染组、转空载体组和转Smac组,取对数生长期细胞进行实验。将构建好的pEGFP-C1-Smac重组质粒在脂质体转染系统作用下转染入转染组MiaPaCa-2细胞,将pEGFP-C1空载体在脂质体转染系统作用下转染入转空载体组MiaPaCa-2细胞,未转染组细胞未予处理,于转染24小时时于荧光显微镜下观察荧光蛋白表达强度。6采用流式细胞仪（FCM）检测Smac转染24小时的细胞凋亡率、细胞周期分布,再给予顺铂（8μg/ml）、吉西他滨（10μg/ml）作用24小时后检测在顺铂、吉西他滨作用下Smac转染对MiaPaCa-2细胞的细胞凋亡率、细胞周期分布和Survivin、Bcl-2蛋白表达的影响。7采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测MiaPaCa-2细胞在顺铂（8μg/ml）、吉西他滨（10μg/ml）作用8、16、24、36、48小时各时段的细胞生长抑制率,观察在顺铂、吉西他滨作用下Smac转染对各组MiaPaCa-2细胞生长抑制率的影响。结果:1质粒检测:pEGFP-C1-Smac重组质粒经PCR、测序鉴定,构建成功。2 pEGFP-C1-Smac重组质粒和pEGFP-C1空载体转染MiaPaCa-2细胞,于荧光显微镜下观察可见,转染pEGFP-C1-Smac重组质粒的细胞自发绿色荧光,表明Smac-EGFP绿色荧光融合蛋白在MiaPaCa-2细胞胞浆内成功表达。3细胞凋亡率变化:①转Smac组胰腺癌细胞的凋亡率（7.01±3.88）%高于未转染组（2.17±0.87）%,转Smac组细胞的细胞凋亡率高于空载体组（4.40±1.49）%,差异均有统计学意义（P<0.05）。而未转染组与空载体组的细胞凋亡率差异无统计学意义。②顺铂作用24小时后转Smac组胰腺癌细胞的凋亡率（6.07±1.53）%高于单纯顺铂作用组（5.80±6.68）%,差异无统计学意义。③吉西他滨作用24小时后转Smac组胰腺癌细胞的凋亡率（7.20±3.26）%高于单纯吉西他滨作用组（6.65±1.76）%,此差异有统计学意义（P<0.05）。4细胞生长抑制率检测:①单纯顺铂作用组在顺铂作用8、16、24、36、48小时的OD570值分别为:0.30±0.061、0.37±0.065、0.37±0.015、0.25±0.021、0.17±0.019,细胞生长抑制率分别为-6.28%、26.11%、47.11%、66.65%、85.70%,其中36小时的生长抑制率高于24小时、48小时的生长抑制率高于24小时,细胞生长抑制率随顺铂作用时间的延长呈升高趋势,差异均有统计学意义（P<0.05）。单纯吉西他滨组在吉西他滨作用8、16、24、36、48小时的OD570值分别为:0.25±0.010、0.30±0.053、0.32±0.066、0.30±0.027、0.33±0.013,细胞生长抑制率分别为22.31%、39.09%、54.94%、60.77%、72.50%,细胞生长抑制率随吉西他滨作用时间的延长呈升高趋势,但各组之间的差异无统计学意义。②转Smac组在继续培养8、16、24、36、48小时的OD570值分别为:0.35±0.038、0.41±0.021、0.26±0.010、0.48±0.047、0.41±0.047,细胞生长抑制率分别为-24.62%、16.25%、62.87%、63.58%、65.55%,其中48小时的生长抑制率高于24小时,差异均有统计学意义（P<0.05）。③转Smac组在顺铂作用8、16、24、36、48小时的OD570值分别为:0.19±0.035、0.18±0.020、0.16±0.034、0.19±0.020、0.14±0.013,细胞生长抑制率分别为44.81%、63.86%、78.02%、74.66%、88.27%,细胞生长抑制率随顺铂作用时间的延长呈升高趋势,但各组之间的差异无统计学意义。转Smac组在吉西他滨作用8、16、24、36、48小时的OD570值分别为:0.27±0.028、0.30±0.016、0.26±0.032、0.22±0.033、0.17±0.047,细胞生长抑制率分别为5.91%、39.21%、63.31%、70.42%、85.71%,其中24小时的生长抑制率高于16小时、48小时的生长抑制率高于24小时,差异均有统计学意义（P<0.05）。④空载体组在顺铂、吉西他滨作用后可见细胞生长抑制率随药物作用时间延长呈增加趋势,但差异无统计学意义。5细胞周期变化:①转Smac组细胞G0/G1期的细胞比例（50.45±0.78）%高于未转染组细胞G0/G1期的细胞比例（45.60±35.68）%,转Smac组细胞S期的细胞比例（35.70±0.71）%低于未转染组（38.05±5.61）%,差异均无统计学意义。②顺铂作用24小时后转Smac组细胞G0/G1期的细胞比例（55.3±9.22）%高于单纯顺铂作用组（34.36±6.48）%,转Smac组细胞S期的细胞比例（20.13±10.76）%低于单纯顺铂作用组（29.30±11.75）%,差异均无统计学意义。③吉西他滨作用24小时后转Smac组细胞G0/G1期的细胞比例（61.93±0.68）%高于单纯吉西他滨作用组（55.56±9.34）%,转Smac组细胞S期的细胞比例为（27.18±6.35）%低于单纯吉西他滨作用组（36.38±10.14）%,差异均无统计学意义。6 Survivin、Bcl-2表达的变化:①转Smac组细胞Survivin的表达（143.56±136.78）低于未转染组（190.19±90.39）,顺铂作用24小时转Smac组细胞Survivin的表达（455.98±98.42）低于单纯顺铂作用组（471.93±25.02）,吉西他滨作用24小时后转Smac组细胞Survivin的表达（471.21±98.42）低于单纯吉西他滨作用组（ 562.17±85.43）,差异均无统计学意义。②转Smac组细胞Bcl-2的表达（52.06±22.29）低于未转染组（83.55±88.04）,差异有统计学意义（P<0.05）。顺铂作用24小时转Smac组细胞Bcl-2的表达（220.23±132.3）低于单纯顺铂作用组（264.86±63.59）,差异无统计学意义。吉西他滨作用24小时后转Smac组细胞Bcl-2的表达（221.3±115.2）低于单纯吉西他滨作用组（284.89±11.8）,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:1过表达Smac对人胰腺癌MiaPaCa-2细胞有促凋亡作用,可显著增加胰腺癌细胞的细胞凋亡率。2过表达Smac可以显著增强MiaPaCa-2细胞在吉西他滨诱导下的细胞凋亡,可以增加吉西他滨的化疗敏感性。3过表达Smac对人胰腺癌MiaPaCa-2细胞有抑制细胞增殖的作用,Smac过表达可以显著增强MiaPaCa-2细胞在顺铂、吉西他滨诱导下的抑制增殖作用,并且有一定的时效性关系。4在顺铂、吉西他滨诱导下,过表达Smac可以改变人胰腺癌MiaPaCa-2细胞的细胞周期。过表达Smac可使胰腺癌细胞G0/G1期的细胞比例增多,S期的细胞比例下降。5人胰腺癌MiaPaCa-2细胞过表达Smac在吉西他滨作用24小时后Bcl-2蛋白的表达显著下调。