克氏原螯虾（Procambarus clarkii）对铜胁迫的免疫响应研究

论文摘要

近年来,随着工、农业的快速发展,我国水域重金属污染日趋严重,给水生生物的生存和繁衍造成了严重的威胁。《中国渔业生态环境状况公报》指出我国近岸海域、江河、湖泊的渔业水域中,Cu2+的污染超标程度仍在增加（《中华人名共和国渔业水质标准》规定Cu2+≤0.01mg/L）。Cu是甲壳动物体内必需的微量营养素,不仅是酚氧化酶、超氧化物歧化酶活性中心的重要因子,也是合成血蓝蛋白的必需成分,但是高浓度的铜亦会对生物体会产生毒害作用。研究表明,生活在富含各种病原体和胁迫因子水体中的甲壳动物,在进化过程中已演替出了一套具有强抗逆性的免疫系统来适应或抵抗环境的胁迫。因此,开展水体铜污染的研究具有重要的意义。克氏原螯虾（Procambarus clarkii）隶属于甲壳纲（Crustacea）、十足目（Decapoda）、螯虾科（Cambaridae）,俗称小龙虾,具有分布广、抗逆性强、对环境条件要求低等特点,近年来被广泛应用于甲壳动物免疫学研究以及指示环境污染的模式实验动物。免疫指标与虾类的生理状态、机体代谢、营养状况及疾病有着密切的关系,尤其当虾类受到外界因子的影响而发生生理或病理变化时,必定会在免疫指标中反映出来。因此,研究重金属对克氏原螯虾的影响,检测免疫相关指标的变化是最为直接和有效的。本研究以克氏原螯虾为研究对象,利用免疫学、毒理学和病理学相结合的方法,通过检测不同浓度Cu2+对螯虾主要免疫因子以及对免疫器官的影响,旨在为利用免疫学方法监测水环境的早期污染提供理论依据,同时也丰富了甲壳动物免疫学的理论。研究结果与结论如下：1水体Cu2+在克氏原螯虾体内的积累与分布本课题通过测定克氏原螯虾半致死浓度,并参考《中国渔业生态环境状况公报》以及国内外相关文献研究的基础上设定Cu2+质量浓度梯度。采用单因子梯度试验,通过在外源水环境中添加0.0、0.5、1.0、3.0、5.0、10.0mg/L的Cu2+,并分别于24 h,48h,72 h和96 h测定其在克氏原螯虾肝胰腺、鳃和肌肉中的积累状况。实验结果表明：三种组织中的Cu2+积累量随着水环境中Cu2+浓度的升高以及诱导时间的延长而增加,即铜积累具有明显的时间-效应与剂量-效应关系；本研究还发现Cu2+蓄积具有明显的组织差异性即鳃>肝胰腺>肌肉,可能与Cu2+浓度较高和诱导时间较短有关。铜在鳃、肝胰腺和肌肉中积累量最高值分别为22.57μg/g、11.84μg/g、1.56μg/g,随着Cu2+浓度的升高,肝胰腺中Cu蓄积速度最快,鳃次之,肌肉最慢。因此,高Cu2+环境中,肝胰腺是铜积累的主要场所,在铜代谢过程中发挥着主要的作用。2水体Cu2+对克氏原螯虾细胞免疫因子的影响研究发现,螯虾的血细胞分为三种类型：透明细胞、小颗粒细胞、大颗粒细胞,经Giemsa染色液染色后发现无颗粒细胞呈蓝色,细胞核染色较深,小颗粒细胞和大颗粒细胞中的颗粒呈红色,核亦呈蓝色,但经Cu2+暴露后,各处理组均未观察到血细胞形态的明显变化；染毒96h内各浓度梯度组的血细胞数均低于对照组,但随着染毒时间的延长及Cu2+浓度的升高血细胞数量的变化无明显的规律性,这可能与个体差异有关；螯虾血细胞对金黄色葡萄球菌的吞噬活性和吞噬指数变化趋势相似,随着铜离子浓度的升高和染毒时间的延长,吞噬活性（PP）和吞噬指数（PI）均逐渐降低。0.5 mg/L处理组PP在染毒初期显著升高,整个试验期间,3.0、5.0和10.0 mg/L浓度组血细胞的PP和PI显著低于对照组（P<0.05）。结果表明,低浓度的Cu2+在短期内能提升螯虾的免疫力,低浓度Cu2+长时间作用或高浓度的Cu2+能使螯虾的免疫力降低,对病原微生物的易感性提高。3 Cu2+胁迫对克氏原螯虾血清、组织和器官中免疫相关酶活性的影响本研究测定了不同浓度Cu2+胁迫下螯虾血清中酚氧化酶（PO）、抗菌活力（Ua）、溶菌活力（Ub）以及血清、肝胰腺和鳃中超氧化物歧化酶（SOD）、酸性磷酸酶（ACP）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）的含量变化。结果表明：与对照组相比,1.0、3.0、5.0和10.0 mg/L组在染毒48h后Ub活力显著下降（P<0.05）；染毒72h后,血清Ua活力显著下降（P<0.05）；血清中PO活性的变化存在时间-剂量的效应关系,96h后各处理组均显著降低（P<0.05）；低浓度Cu2+（0.5mg/L）诱导后在较短时间内对螯虾血清、肝胰腺和鳃中SOD和CAT均具有激活作用,随着时间的延长则表现出抑制效应,而高浓度Cu2+处理均表现为抑制效应,差异显著（P<0.05）且肝胰腺中两种酶活力均高于鳃；螯虾肝胰腺中MDA活力的变化较鳃和血清中显著,低浓度Cu2+诱导后在较短时间内螯虾MDA活性低于对照组,随着时间的延长及Cu2+浓度的升高MDA活性出现升高的趋势,且MDA活力的变化与SOD活力变化呈现出负相关性,所以利用螯虾的免疫系统预测水环境重金属污染具有现实和理论意义。4水体Cu2+对克氏原螯虾肝胰腺显微结构的影响Cu2+胁迫下,克氏原螯虾肝小管明显增厚,单层柱状细胞肿大,管腔变细,肝小管基膜出现波纹状拱起；血窦腔中的血细胞数量明显增多,并且在肝小管基膜断裂处与柱状上皮细胞充挤在一起；5.0 mg/L Cu2+浓度胁迫后部分柱状细胞已变性,基膜与柱状细胞之间出现空泡；10.0 mg/L Cu2+浓度胁迫后,单层柱状细胞变性甚至解体,在管腔中出现细胞碎片,肝胰腺中血细胞增多,基膜与单层柱状细胞之间出现巨大的空泡。本研究结果显示高浓度Cu2+对克氏原螯虾肝胰腺的显微结构产生明显的损伤。综上所述,克氏原螯虾对铜胁迫的免疫应答机制可能是水体Cu2+主要通过鳃吸收进入血淋巴,最终主要在鳃和肝胰腺中积累；当Cu2+随着血淋巴循环到达全身各处时,首先对机体的相关免疫指标产生了影响,然后才对组织器官和个体产生影响。由于各种免疫因子的结构、性质和功能不同,其活性变化受Cu2+胁迫程度也各有差异,因此综合利用螯虾的各种免疫指标来监测水体环境中Cu2+污染的程度具有可行性；随着Cu2+浓度的升高,克氏原螯虾的肝胰腺组织结构产生了不可逆性的病理变化,进而影响到螯虾的生长甚至导致其死亡,更能反映出铜污染程度大小。本研究初步揭示克氏原螯虾对Cu2+胁迫的免疫应答机制。这不仅丰富了甲壳动物免疫学的内容,而且为螯虾的健康养殖和预警水环境中Cu2+早期污染提供了参考,同时为其它重金属在免疫学、毒理学等方面的研究提供了参考。

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ABSTRACT

第一章文献综述

1.1 甲壳动物免疫机制的研究概况

1.2 水体重金属对甲壳动物免疫功能的影响

1.3 本论文的研究的背景、目的及意义

2+在克氏原螯虾体内积累和分布状况'>第二章水体Cu²⁺在克氏原螯虾体内积累和分布状况

2.1 材料与方法

2.2 结果

2.3 讨论

2+胁迫对克氏原螯虾细胞免疫因子的影响'>第三章水体Cu²⁺胁迫对克氏原螯虾细胞免疫因子的影响

3.1 材料与方法

3.1.1 实验材料

3.1.2 主要试剂的配制

2+浓度梯度及染毒时间的设置'>3.1.3 Cu²⁺浓度梯度及染毒时间的设置

3.1.4 血细胞数量测定及形态观察

3.1.5 血细胞对金黄色葡萄球菌的吞噬活性和吞噬指数的测定

3.1.6 数据分析

3.2 结果与分析

2+对克氏原螯虾血细胞数目及形态的影响'>3.2.1 Cu²⁺对克氏原螯虾血细胞数目及形态的影响

3.2.2 血细胞对金黄色葡萄球菌的吞噬活性（PP）和吞噬指数（PI）的影响

3.3 讨论

3.3.1 铜胁迫对螯虾血细胞数量的影响

3.3.2 血细胞对金黄色葡萄球菌的吞噬活性和吞噬指数的影响

2+胁迫对克氏原螯虾血清中免疫相关酶活性的影响'>第四章水体Cu²⁺胁迫对克氏原螯虾血清中免疫相关酶活性的影响

4.1 材料与方法

4.1.1 实验材料

2+浓度梯度及染毒时间的设置'>4.1.2 Cu²⁺浓度梯度及染毒时间的设置

4.1.3 样品处理

4.1.4 血清抗菌活力（Ua）的测定

4.1.5 血清溶菌活力（Ub）的测定

4.1.6 血清酚氧化酶活力（PO）测定

4.1.7 血清中酸性磷酸酶（ACP）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和丙二醛（MAD）测定

4.1.8 数据处理与分析

4.2 结果

2+对螯虾血清抗菌（Ua）及溶菌活力（Ub）的影响'>4.2.1 Cu²⁺对螯虾血清抗菌（Ua）及溶菌活力（Ub）的影响

2+对螯虾血淋巴中酚氧化酶（PO）活性影响'>4.2.2 Cu²⁺对螯虾血淋巴中酚氧化酶（PO）活性影响

2+对螯虾血清酸性磷酸酶（ACP）活力的影响'>4.2.3 Cu²⁺对螯虾血清酸性磷酸酶（ACP）活力的影响

2+对螯虾血清超氧化物歧化酶（SOD）活力的影响'>4.2.4 Cu²⁺对螯虾血清超氧化物歧化酶（SOD）活力的影响

2+对螯虾血清中过氧化氢酶（CAT）活力的影响'>4.2.5 Cu²⁺对螯虾血清中过氧化氢酶（CAT）活力的影响

2+对螯虾血清MDA活力的影响'>4.2.6 Cu²⁺对螯虾血清MDA活力的影响

4.3 讨论

4.3.1 铜胁迫对螯虾抗菌活力（Ua）的影响

4.3.2 铜胁迫对螯虾溶菌活力（Ub）的影响

4.3.3 铜胁迫对螯虾酚氧化酶（PO）的影响

4.3.4 铜胁迫对螯虾酸性磷酸酶活性（ACP）的影响

4.3.5 铜胁迫对螯虾SOD和CAT的影响

4.3.6 铜胁迫对螯虾MDA活力的影响

2+胁迫对克氏原螯虾肝胰腺和鳃中相关酶活性的影响'>第五章水体Cu²⁺胁迫对克氏原螯虾肝胰腺和鳃中相关酶活性的影响

5.1 材料与方法

5.1.1 实验材料

2+浓度梯度及染毒时间的设置'>5.1.2 Cu²⁺浓度梯度及染毒时间的设置

5.1.3 样品处理

5.1.4 肝胰腺和鳃中ACP、SOD、CAT、MAD测定

5.1.5 数据处理与分析

5.2 结果

2+对螯虾肝胰腺和鳃ACP活力的影响'>5.2.1 Cu²⁺对螯虾肝胰腺和鳃ACP活力的影响

2+对螯虾肝胰腺和鳃SOD活力的影响'>5.2.2 Cu²⁺对螯虾肝胰腺和鳃SOD活力的影响

2+对螯虾肝胰腺和鳃CAT活力的影响'>5.2.3 Cu²⁺对螯虾肝胰腺和鳃CAT活力的影响

2+对螯虾肝胰腺和鳃MDA活力的影响'>5.2.4 Cu²⁺对螯虾肝胰腺和鳃MDA活力的影响

5.3 讨论

5.3.1 铜胁迫对螯虾肝胰腺和鳃中ACP的影响

5.3.2 铜胁迫对螯虾肝胰腺和鳃中SOD和CAT的影响

5.3.3 铜胁迫对螯虾肝胰腺和鳃中MDA的影响

2+对克氏原螯虾肝胰腺显微结构的影响'>第六章水体Cu²⁺对克氏原螯虾肝胰腺显微结构的影响

6.1 材料与方法

6.1.1 实验材料

6.1.2 染毒方法

6.1.3 主要试剂

6.1.4 光镜组织切片的制作

6.2 结果

6.3 讨论

文章小结

参考文献

研究成果

致谢

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