猪骨骼肌特异性表达载体的构建

论文摘要

为提高转基因猪的生产水平,使外源基因能够在猪骨骼肌特异高效地表达,必须构建一个特异高效表达的表达载体,其中启动子的选择非常重要。我们首先改造了无启动子的红色荧光蛋白载体,添加了增强子,IRES等元件以满足分析需要,然后分析猪αactin,CKM,CAPN 3、CA 3、TNNI 2、CASQ 1、GEM等7种骨骼肌特异性表达基因5′调控区的转录因子结合位点,确定需要克隆的区间,经PCR获得目的启动子片段,酶切连入无启动子的报告基因载体中,瞬时转染成肌细胞并诱导分化,同时转染其他组织来源的细胞为对照,包括心肌细胞,肾细胞,内皮细胞,成纤维细胞,肝细胞,研究结果如下:1.αactin,CKM,CAPN 3的启动子仅在诱导分化的肌细胞中有启动活性,在其他来源的细胞中无启动活性2.其他猪骨骼肌特异性基因的启动子在骨骼肌中未检测到启动活性,在其他组织来源的细胞中也未检测到启动活性3. GEM启动子在多种组织来源的细胞中均有启动活性4.得到三种猪骨骼肌特异性表达载体:CMV Enhancer-αactinPromoter-pIRES-DsRed,CMV Enhancer-CKM Promoter-pIRES-DsRed,CMV Enhancer-CAPN3 Promoter-pIRES-DsRed。5.得到了一种广泛性表达的启动子:CMV Enhancer-CKM Promoter-pIRES-DsRed骨骼肌特异性表达载体仅在骨骼肌中有启动活性,而在除骨骼肌外的多种细胞中均无启动活性,可以利用这些启动子在骨骼肌中特异性地启动下游基因的表达,不仅能用于猪转基因生产,还可在哺乳动物转基因应用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 启动子的研究进展
• 1.2 组织特异性启动子
• 1.3 乳腺特异性表达载体
• 1.4 骨骼肌的特性
• 1.5 骨骼肌特异性基因
• 1.5.1 肌动蛋白
• 1.5.2 肌酸激酶
• 1.5.3 钙蛋白酶
• 1.6 内部核糖体进入位点
• 1.7 荧光蛋白
• 1.8 常用转染方法
• 2 材料与方法
• 2.1 试验动物和样品采集
• 2.2 主要仪器设备
• 2.3 分子生物据库及软件
• 2.4 主要试剂及来源
• 2.5 试验方法
• 2.5.1 常用试剂的配制
• 2.5.2 耳组织基因组DNA 的提取
• 2.5.3 PCR 扩增与片段纯化
• 2.5.4 DNA 连接与转化
• 2.5.5 质粒DNA 的制备
• 2.5.6 无启动子IRES-DsRed 载体构建
• 2.5.7 启动子分析载体的构建
• 2.5.8 质粒去内毒素处理
• 2.5.9 细胞培养
• 2.5.10 细胞传代、冻存与复苏
• 2.5.11 细胞转染与最优条件的确定
• 3 结果与分析
• 3.1 启动子区的PCR 扩增与回收
• 3.2 各种细胞最优转染方案
• 3.3 各启动子表达载体细胞转染结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 6 参考文献
• 7 致谢
• 硕士学位论文内容简介及自评