黄瓜白粉病抗性遗传分析和基因定位研究

论文摘要

黄瓜白粉病（powdery mildew,PM）是由专性活体寄生真菌引起,在温室和大田都普遍发生的叶部病害;其病原菌主要包括瓜单囊壳（Podosp -haera xanthii）和二孢白粉菌（Golovinomyces cichoracearum）两属;中国以瓜单囊壳危害较为普遍。白粉病病原菌寄主广泛,可以感染黄瓜植株叶片、茎和花,在开花期感染白粉病可减少产量30～50%。培育和应用抗性品种是抵御黄瓜白粉病危害的根本途径。据文献报道,黄瓜高抗白粉病品种较少,利用常规育种技术选育抗性品种有很大的困难。为了分子标记辅助育种和抗性基因分离,本文对黄瓜白粉病抗性进行了遗传分析和抗性基因定位研究。1.应用温室喷雾接种法,对从国内外收集的120份黄瓜种质材料进行两次重复接种鉴定。接种菌为上海地区优势黄瓜白粉菌生理种,经单孢分离和纯化。共鉴定出高抗材料17份,耐病材料（中抗,中感）82份,高感病材料21份。高抗材料包括中国10份,中国台北、日本各2份,美国、荷兰、菲律宾各1份。本试验为培育黄瓜抗病品种和跨种植区引种,提供了良好的技术支持。2.以华北类型黄瓜自交系S94（感白粉病,母本）和欧洲温室型黄瓜自交系S06（抗白粉病,父本）为亲本材料,配置F6群体,构建了一张黄瓜分子标记遗传图谱。该图谱包括7个连锁群,含有257个标记,包括206个SRAP （sequence-related amplified polymorphism）标记,22个SSR（simple sequence repeat）标记,25个SCAR（sequence charact- erized amplified region）标记,1个STS（sequence tagged site）标记和3个形态学标记,图谱总长度1005.9cM,标记平均间距是3.9cM。3.对黄瓜自交系S94和S06及其由它们构建的130个F2:3家系,分别利用温室人工喷雾接种法（2005秋、2006春）和叶盘法（2005秋）进行白粉病抗性鉴定;并使用该群体对应的分子标记连锁图进行数量性状座位（quantita -tive trait loci,QTL）分析。使用复合区间定位方法共检测到5个白粉病抗性QTLs（pm1.1,pm1.2,pm2.1,pm2.2和pm5.1）,分布于连锁群1、2和5,单个QTL的贡献率介于3.4%～45%之间。其中pm1.1,pm2.1和pm5.1在温室人工喷雾接种法和叶盘接种法都能检测到。4.同时还利用黄瓜自交系S94和S06及其由它们构建的224个F6:7家系的重组自交系（recombinant inbred lines,RIL）群体,分别在2005年秋和2006年春温室喷雾接种,进行白粉病抗性遗传分析;并在对应分子标记遗传图谱上,使用复合区间定位方法检测白粉病抗性QTLs。结果显示,在两种环境里共检测到黄瓜白粉病抗性的4个QTLs（rpm1.1、rpm2.1、rpm4.1和rpm6.1）,分别分布于连锁群1、2、4和6上,单个QTL解释贡献率介于5.2%～21.0%之间,rpm4.1的表型贡献率最高（20.5%- 2005年秋,21.0% -2006年春）。其中rpm1.1、rpm2.1和rpm4.1在两种环境中均被稳定重复检测到,rpm6.1只在2005年秋被检测到。两种环境下检测的QTLs解释表型变异总和分别是52.0%（2005秋）和42.0%（2006春）。把F6:7与F2:3群体定位的白粉病QTL相比较发现,rpm1.1和rpm2.1分别与pm1.2和pm2.1附近的标记相同,应该为相同的QTL。但不同世代群体间相同的QTL,存在表型变化贡献率和加性等位基因来源方向不一致的现象。生产实践中,杀菌剂也被大量用于植物病害防治。使用杀菌剂,一方面增加了病原小种的变异率,另一方面表现出环境不友好和食品污染等问题。为了饮食健康,研究人员积极开发寻找高效、环保的控病措施。已有报道,Vitamin B1能作为激发子,诱导拟南芥、水稻和烟草产生抗病性。本研究对Vitamin B1作为激发子提高黄瓜白粉病抗性的作用机理进行了初步研究。1.通过考察Vitamin B1处理黄瓜幼苗白粉病发病的病情指数,确定50mmol/L Vitamin B1为最佳处理浓度,此浓度处理比对照水处理后的病情指数减少38%。2.用50mmol/L-Vitamin B1处理黄瓜感白粉病自交系S52第1片真叶,4h后第1片真叶接种黄瓜白粉病菌,分时间段取心叶提取叶片RNA,利用实时荧光定量PCR检测病程相关标记基因[病程相关蛋白-1a（pathoge-nesis-related protein-1a,PR-1a）基因、过氧化物酶（acidic peroxi -dase,POX）基因、脯氨酸裂解酶(phenylalanine amonia-lyase,PAL基因]与对照水处理0h相比的表达变化。结果发现3个基因72h内都表现出表达先快速增加,后降低的变化;表达量最大变化,分别出现在12h、48h和12h;分别是水对照的3.1、4.9和2.5倍。结果初步表明Vitamin B1预处理黄瓜自交系S52幼苗,能引起系统获得抗性（systemic acquired resistance,SAR）反应,使S52获得对白粉病的系统抗性。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略语
• 第一部分
• 第一章 绪论
• 第一节 DNA 分子标记与 QTL 分析
• 1. DNA 分子标记技术
• 1.1 随机扩增的多态性（random amplified polymorphic DNA, RAPD）
• 1.2 微卫星（simple sequence repeat,SSR） 标记
• 1.3 序列相关扩增多态性（sequence-related amplified polymorphism,SRAP）标记
• 1.4 序列特异性扩增区（sequence-characterized amplified region,SCAR）标记
• 1.5 特定序列位点（sequence-tagged site, STS）标记
• 1.6 分子标记的用途
• 2. QTL（quantitative trait loci）作图方法
• 2.1 单标记作图法（individual-marker mapping,IMM）
• 2.2 区间作图法（interval-mapping,IM）
• 2.3 复合区间作图法（composite interval mapping,CIM）
• 2.4 基于混合模型的复合区间作图法
• 2.5 QTL 定位的统计软件和阈值
• 2.6 QTL 定位研究存在的问题
• 3 基因（或 QTL）定位在分子标记辅助选择和定位克隆方面的应用
• 3.1 分子标记辅助选择
• 3.2 影响分子辅助选择效率的因素
• 3.3 定位克隆
• 第二节 我国黄瓜生产和抗白粉病育种现状
• 1. 黄瓜生产概况
• 2. 黄瓜白粉病的研究概况
• 2.1 黄瓜白粉病的病原研究进展
• 2.2 黄瓜白粉病的国内外遗传分析和分子标记定位研究
• 第三节 本研究的目的和意义
• 第二章 黄瓜种质白粉病抗性鉴定
• 1 材料和方法
• 1.1 鉴定材料
• 1.2 病菌保存
• 1.2.1 单个粉霉堆采集
• 1.2.2 菌种繁殖和保存
• 1.3 接种准备
• 1.4 抗性测试的评价标准
• 2 结果与讨论
• 2.1 黄瓜种质抗病性鉴定及综合评价
• 2.2 黄瓜种质白粉病抗源基因挖掘
• 2.3 黄瓜白粉病鉴定的困难
• 第三章 黄瓜白粉病抗性遗传分析 及 QTL 定位
• 1.材料与方法
• 1.1 分离群体构建
• 1.2 遗传图谱构建
• 1.2.1 基因组 DNA 提取
• 1.2.2 标记分析
• 1.2.3 数据采集与连锁分析
• 1.3 病菌保存
• 1.4 白粉病抗性鉴定
• 1.4.1 温室喷雾接种和病级
• 1.4.2 叶盘测试和病级
• 1.5 QTL 分析
• 1.6 统计分析
• 2.结果与分析
• 2.1 遗传图谱构建
• 2.1.1 亲本间多态标记的筛选
• 2.1.2 连锁图谱
• 2.2 白粉病抗性遗传分析与QTL 定位
• 2:3家系'>2.2.1 F_2:3家系
• 2:3家系白粉病抗性'>2.2.1.1 双亲及F_2:3家系白粉病抗性
• 2遗传图谱'>2.2.1.2 F₂遗传图谱
• 2.2.1.3 在温室喷雾法鉴定抗性 QTL
• 2.2.1.4 叶盘测试法鉴定抗性QTL
• 6:7家系'>2.2.2 F_6:7家系
• 6:7家系白粉病抗性分析'>2.2.2.1 双亲及F_6:7家系白粉病抗性分析
• 2.2.2.2 温室喷雾法鉴定抗性QTL
• 2.2.3 不同世代群体QTLs 定位结果比较
• 3 讨论
• 3.1 分子标记遗传图谱
• 3.1.1 亲本多态性
• 3.1.2 遗传图谱构建
• 3.2 抗病鉴定方法比较
• 3.3 白粉病抗性遗传分析
• 3.4 QTL 定位
• 2：3家系QTL'>3.4.1 F_2：3家系QTL
• 6：7家系QTL'>3.4.2 F_6：7家系QTL
• 3.4.3 影响QTL 定位结果的因素
• 3.4.4 QTL定位前景与问题
• 第四章 本部分结论及后续工作展望
• 第二部分
• 第一章 文献综述
• 第一节 系统获得性抗性
• 1.1 诱抗物的种类
• 1.1.1 非生物因子
• 1.1.2 生物因子
• 1.2 植物诱导抗性的机理
• 1.2.1 植物SAR 的建立
• 1.2.2 与 SAR 相关的基因诱导
• 1.2.3 SAR 机理研究现状
• 1.3 不同的信号途径
• 1.4 茉莉酸参与诱导抗性
• 1.5 植物诱导抗病性的特点
• 1.6 植物诱导抗病性应用
• 第二节 本研究目的与意义
• 第二章 激发子-Vitamin B1 对于黄瓜白粉病诱导抗性分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试激发子、黄瓜材料和黄瓜白粉菌
• 1.2 主要试剂和仪器
• 1.3 试验方法
• 1.3.1 白粉病抗性激发子筛选
• 1.3.2 Vitamin B1 浓度筛选
• 1.3.3 Vitamin B1处理相关基因表达的测定
• 1.3.4 组织总RNA 制备
• 1.3.5 cDNA合成
• 1.3.6 病程防卫标记基因的引物设计和定量PCR
• 2 结果与分析
• 2.1 抗性激发子筛选结果
• 2.2 Vitamin B1 对黄瓜幼苗病情指数的影响
• 2.3 RNA 纯度和完整性分析
• 2.4 病程防卫标记基因的扩增引物
• 2.5 标记基因的表达变化
• 3.讨论
• 3.1 Vitamin B1能引起黄瓜的SAR
• 3.2 Vitamin B1作用机理相关研究
• 3.3 Vitamin B1 适合作激发子
• 3.4 Vitamin B1开发潜力
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文