论文摘要
精子超活化在受精过程中起重要作用,发生在精子获能的最后阶段,是可育精子必须经历的过程。精子超活化是动物生殖生物学研究的热点之一,但引发的分子机制尚不完全清楚。精子超活化的研究对男性避孕药研制、促进受孕和男性生育能力下降原因的揭示等有重要意义。本研究用RNAi技术研究精子超活化信号传导通路的分子机制,建立RNAi沉默精子靶基因表达技术体系,对重要控制基因sAC的功能和作用机制进行详细研究。我们首先利用生物信息学方法对sAC基因进行全面分析研究,设计4个基因特异的siRNAs;通过电转化方法把siRNA转化到成熟精子中,荧光定量PCR、Western blot和ELISA等方法分析sAC及其产物的变化,CASA方法分析精子超活化水平,根据这些指标鉴定sAC基因的最佳干涉靶位点。筛选的2个最佳干涉siRNA序列构建成shRNA载体,睾丸网微注射和电转化相结合的方法把质粒转到大鼠睾丸网中,分别在0、7、15、30和42天收集大鼠精子样品,荧光定量PCR、Western blot和ELISA等方法分析sAC以及其产物的变化,CASA方法分析精子超活化水平。本研究的结果将获得sAC最佳的干涉位点,为男性避孕药开发提供重要参考;同时在基因和蛋白两个层次上,对精子超活化通路进行分析,对明确sAC在精子超活化细胞信号通路中发挥的作用具有重要意义。本研究取得了以下结果:一、大鼠sAC的生物信息学分析大鼠sAC的生物信息学分析表明,选择性剪切的46 KDa sAC比全长sAC具有更高的稳定性;46 KDasAC为疏水性蛋白,有利于形成α螺旋,保证其稳定性,利于蛋白质向内部折叠形成二级结构;三级结构预测表明,46 KDa sAC两个Guanylatecyc结构域靠在一起,形成能够容纳目的分子并进行催化反应的小腔。说明46 KDa sAC是主要的存在形式,也是主要的活性功能分子。MEGA5软件对动物AC和GC构建系统发育树进行分析,结果分成四个亚群:具有跨膜结构域的鸟苷酸环化酶tmGC,可溶性鸟苷酸环化酶sGC,具有跨膜结构域的腺苷酸环化酶tmAC和可溶性腺苷酸环化酶sAC。sACs和tmACs有两个Guanylatecyc结构域,而sGCs和tmGCs只有一个Guanylatecyc结构域。从进化树上可以看出,sAC可能是AC和GC的祖先,为了功能的多样性而变异进化,推测AC和GC的结构域不仅形式上一样,功能也类似。sAC进化和物种进化趋势是一致的,说明sAC的变化是随着物种演化而发生变化的。从爬行纲开始sAC基因发生一次重复,变成两个拷贝（sAC和sAC-like）。并不是所有物种都保留下两个sAC,大部分在基因重复之后马上丢失一个,比如人、小鼠和大鼠等就只有一个拷贝。二、siRNA干扰大鼠sAC基因对体外精子超活化的影响电转化是精子转染siRNA的一种有效方式,以转染参数400 V×200μ×3次转染效果最佳,最高转染效率和精子存活率分别达到92.6%和85.1%（P<0.05）。设计的4个sAC特异siRNA序列电转化到成熟精子中,培养12小时的转化精子,sAC基因表达没有明显变化,但当培养24小时时,电转化Actb-717和Actb-4205 siRNA的精子sAC表达下降49.1～50.5%,蛋白质水平下降26.3～30.8%,差异显著（P<0.05）。这两个被干涉的精子cAMP水平和酪蛋白磷酸化水平也明显下降;CASA测定的VCL和ALH下降差异显著,表明精子超活化水平降低。以上结果表明,Actb-717和Actb-4205是沉默sAC的最佳位点,下调sAC的表达影响了大鼠精子超活化水平。精子超活化相关基因的分析表明,sAC基因下调的同时,CatSer2、LDHC和PKA基因的表达也下调,提示sAC可能在精子超活化调控通路中起反馈调节的作用。三、shRNA介导sAC基因沉默对大鼠精子超活化的影响设计 Actb-717 和 Actb-4205 位点的 shRNA717 和 shRNA4205,连接到 pGPU6/GFP表达载体上,通过质粒微注射睾丸网和电转化相结合的方法沉默大鼠附睾精子sAC基因表达。结果显示,精子细胞中能够表达GFP蛋白。流式细胞仪检测不同实验阶段精子细胞中信号表达,随着转化时间的延长,shRNA在精子中的表达增强,GFP信号相应也增强,在转化15天时,shRNA717和shRNA4205检测到的GFP信号分别到达92.8%（shRNA717）和95.5%（shRNA4205）,达到最大值。随着注射时间增加,精子GFP信号数量减少,在实验42天时降低到了 81.7%（shRNA717）和85.6%（shRNA4205）。干涉后的第15天,sAC基因mRNA的干涉效率最大,分别为49.0%（shRNA717）和 65.0%（shRNA4205）,差异显著（P<0.05）。Western blot 和 ELISA方法分析表明,sAC蛋白在干涉15天时干涉效率最大,分别为shRNA717的41.0%、39.2%和shRNA4205的53.1%、43.1%,差异显著（P<0.05）。随着实验时间的延长,sAC表达和蛋白合成表现为上升趋势。在干涉15天时,精子cAMP含量降到了最低,分别为 shRNA717 的 3.48±0.02（pmol/106精子）和 shRNA4205 的 3.40±0.07（pmol/106精子）,与对照的4.89±0.14（pmol/106精子）相比,分别下降了28.8%和30.1%,差异显著（P<0.05）。同样随着实验时间的增加,cAMP含量也相应增加。不同转化酪蛋白磷酸化的变化趋势和cAMP相一致,也是在转化15天时出现最低值,分别为25.6%（shRNA717）和28.2%（shRNA4205）。CASA实验表明,在电转化实验15天时,电转化shRNA717和shRNA4205的精子VCL和ALH发生了明显变化。在转化shRNA717的大鼠精子中,VCL和ALH两个参数与对照相比分别显著下降27.4%和20.8%（P<0.05）;而在转化shRNA4205的大鼠精子中,VCL和ALH两个参数与对照相比分别显著下降38.5%和26.7%（P<0.05）。实验结果表明,shRNA717和shRNA4205是最佳的两个sAC的干涉序列。实验揭示了 cAMP和酪蛋白磷酸化含量与sAC蛋白的变化密切相关,表明sAC在cAMP信号通路中直接发挥作用影响精子超活化。总之,本研究发现了两个能有效下调sAC基因表达的干涉位点Actb-717和Actb-4205。sAC蛋白水平的降低减少了对ATP和Ca2+的利用,从而CatSper2和LDHC被反馈抑制。基于以上的实验结果得出:sAC是精子超活化过程中的中心因子,它能够调节上下游基因表达,还能够通过产物来调节下游蛋白磷酸化水平,直接影响精子超活化。