论文摘要
猪轮状病毒（Porcine rotavirus,PoRV）属于呼肠孤病毒科轮状病毒属,是引起仔猪病毒性腹泻的主要病原之一。被PoRV感染的仔猪主要表现为腹泻、呕吐,严重者脱水,给养猪业带来严重的危害。PoRV存在多种血清型,且各个血清型之间无交叉保护或交叉保护性很差。资料显示,我国猪群中轮状病毒的感染以A群为主,在A群PoRV中VP6蛋白是群抗原,在各毒株中高度保守。目前,我国PoRV的诊断主要还是依赖于常规实验室诊断,其操作过程复杂、耗时,并且需要昂贵的仪器。因此,针对PoRV敏感性强、特异性高并能应用于现地的快速诊断方法的建立是十分必要的。本试验以A群PoRV代表株OSU毒株（G5型）为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,制备了8株抗PoRV的单克隆抗体,分别命名为1D5、1B5、1G9、1C7、3C10、1F10、1D11、1F3。ELISA结果表明,8株单克隆抗体腹水的效价分别为:1:6400、1:12800、1:25600、1:12800、1:6400、1:6400、1:25600和1:6400。类—亚类—型鉴定结果显示,1D5、1B5和1C7属于IgM类,1G9、3C10、1F10和1F3属于IgG2b亚类,1D11属于IgG2a亚类,而其轻链均为κ链。Western-blot结果表明,1D5、1G9、1C7、1F10和1D11单克隆抗体与PoRV VP6蛋白反应,1B5、3C10和1F3单克隆抗体与PoRV VP7蛋白反应。叠加ELISA结果显示,进行抗原表位的初步分析,8株单抗识别5个不同的抗原表位,即1D5和1F10单克隆抗体针对同一表位、1G9单克隆抗体针对一个表位、1C7和1D11单克隆抗体针对同一表位、1B5和1F3单克隆抗体针对同一表位、3C10单克隆抗体针对一个表位,单克隆抗体相对亲和力大小为1B5>1D11>1D5（1C7、1F10、1F3）>1G9>3C10。胶体金免疫层析技术具有快速简便、准确直观等优点,结合单克隆抗体技术又具有良好的特异性和敏感性,是目前现地应用最广泛的一种诊断方法。本试验利用抗A群PoRV OSU毒株（G5型）VP6蛋白的1G9和1D11单克隆抗体为探针制备了检测PoRV的胶体金免疫层析试纸条。利用柠檬酸三钠还原法分别制备粒径约为20 nm和40 nm的胶体金。然后用均一性好的20 nm的胶体金标记1G9的单克隆抗体（即单克隆抗体1G9︰胶体金=8.57μg︰1 mL胶体金）,同时用纯化的1D11单克隆抗体（2.4μg/cm）和羊抗鼠IgG二抗（3.2μg/cm）包被M135硝酸纤维素膜分别作为检测线和质控线,与金标垫组装成试纸条。敏感性试验结果表明,本试验制备的胶体金试纸条可以检出5.4μg/mL纯化的PoRV OSU毒株抗原和1.0×103.4 TCID50/mL病毒。在特异性试验中,用制备的试纸条对PoRV OSU毒株（G5型）、PoRV JS毒株（G9型）、牛轮状病毒NCDV毒株（G6型）、羊轮状病毒LLR-85毒株（G10型）、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒进行了检测,结果显示,PoRV OSU毒株（G5型）、PoRV JS毒株（G9型）、牛轮状病毒NCDV毒株（G6型）、羊轮状病毒LLR-85毒株（G10型）为阳性,其余均为阴性。在现地试验中,对我国部分省市37份仔猪腹泻的粪便样品进行了检测,结果表明,本试验制备的胶体金试纸条与韩国的PoRV胶体金试纸条的符合率为91.7 %（11/37,12/37）。本研究结果表明,利用抗A群PoRV OSU毒株（G5型） VP6蛋白的特异性单克隆抗体建立的PoRV胶体金免疫层析试纸条具有良好的敏感性和特异性,与国外同类试剂盒有较高的符合率。该研究结果为我国PoRV的诊断及免疫预防提供技术手段。
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标签：猪轮状病毒论文; 单克隆抗体论文; 胶体金免疫层析法论文; 胶体金论文;