人类脐血干细胞移植对大鼠外伤性视神经损伤的疗效及其作用机制的研究

论文摘要

目的建立大鼠定量视神经损伤模型,为研究视神经损伤后的治疗奠定基础。方法健康SD大鼠54只,随机分为三组,分别为损伤组（A组）、假损伤对照组（B组）、正常对照组（C组）。A组24只大鼠,左眼为损伤眼,右眼为未损伤眼,作为对照,按损伤后存活时间不同分为3d组、7d组、14d组、28d组,每组6只,暴露视神经,应用40g力的视神经夹在大鼠眼球后2mm处夹视神经30s；B组24只大鼠,左眼为假损伤眼,右眼为未损伤眼,作为对照,按损伤后存活时间不同分为3d组、7d组、14d组、28d组,每组6只,仅暴露视神经但不进行钳夹损伤；6只为正常对照组。均于处死前7d采用双上丘注射5%荧光金（FG）标记双眼视网膜神经节细胞。取眼球标本并分离视神经至视交叉。视网膜铺片荧光照相,RGCs计数及RGCs标识率计算。并对视网膜切片进行苏木精-伊红染色,观察视神经损伤后视网膜形态学变化。结果1.FG逆行标记进行RGC计数及RGCs标识率：损伤组各时间点损伤眼RGCs计数（3d组152.26±25.12,7d组111.19±20.32,14d组101.23±17.19,28d组94.86±18.26）与非损伤眼（3d组192.16±32.12,7d组189.26±26.16,14d组191.76±25.29,28d组186.56±23.76）比较,差异均有显著性（P<0.05）。正常对照组及假损伤对照组左、右眼RGCs比较,差异无显著性（P>0.05）。2.损伤眼视神经损伤后不同时间RCCs计数（3d组152.26±25.12,7d组111.19±20.32,14d组101.23±17.19,28d组94.86±18.26）逐渐下降（P<0.05）,各时间点RCCs计数两两比较,14d组与28d组间差异无显著性（乃0.05）,其他时间点间比较差异均有显著性（P<0.05）。视神经损伤后RGCs标识率（3d组79.35%±8.29%,7d组59.76%±7.79%,14d组53.26%±7.26%,28d组51.29%±3.26%）随时间延长渐进性降低（P<0.05）。各时间点RGCs标识率两两比较,14d组与28d组间差异无显著性（P>0.05）,其他时间点间比较差异均有显著性（P<0.05）。正常对照组及假损伤对照组不同时间点RCCs计数及RGCs标识率差异均无显著性（P>0.05）。3.组织病理改变：损伤组：视神经损伤后,视网膜神经节细胞层出现核固缩、视网膜各层变薄、细胞排列紊乱、视网膜神经节细胞减少,致伤后不同时间点上述改变的程度不同。损伤处视神经肿胀、出血,胶质细胞排列紊乱,空泡样变性,随损伤后时间延长而加重。正常对照组及假损伤对照组未见明显病理改变结论应用40g力视神经夹在大鼠眼球后2mm处夹视神经30s能成功建立定量视神经损伤动物模型。目的观察研究人脐血干细胞（hUCBSC）移植对视神经部分受损S-D大鼠视网膜节细胞（RGCs）的保护作用。方法将96只健康成年S-D大鼠随机分为六组,每组16只,均使用第一章得到的方法在成年SD大鼠造成部分视神经损伤模型,均损伤左眼。A组：伤后1周玻璃体腔注射脐血干细胞载体（PBS）,B组：伤后1周玻璃体腔注射神经营养因子,C组：伤后1周玻璃体腔注射hUCBSC,D组：伤后1周玻璃体腔注射hUCBSC+神经营养因子,E组：伤后1周球周注射hUCBSC,F组：伤后1周尾静脉注射hUCBSC。六组分别于注射后7d、14d、21d、28d处死动物。处死前7天双上丘注射5%荧光金（FG）逆行标记双眼RGCS。然后按时间先后处死大鼠分离视网膜置于荧光显微镜下,计数RGCs并计算RGCs标识率,进行统计分析。结果A、B、C、D四组视神经损伤眼RGCs计数均低于未损伤眼（P<0.05）,且随时间延长四组RGCs标识率均呈下降趋势,且组内前后时间段比较均有显著性差异（P<0.05）,但B组、C组、D组下降幅度明显较A组平缓。同时间段组间比较显示B组、C组、D组RGCs标识率均高于A组,且差异均具有显著性（P<0.05）。D组RGCs标识率均高于B组、C组,且差异均具有显著性（P<0.05）。B组RGCs标识率与C组无显著性差异（P>0.05）。C、E、F三组视神经损伤眼节细胞计数均低于未损伤眼（P<0.05）,且随时间延长三组RGCs标识率均呈下降趋势,且组内前后时间段比较均有显著性差异,但C组下降幅度明显较E组、F组平缓。同时间段组间比较显示C组RGCs标识率高于E组、F组,且差异均具有显著性（P<0.05）。E组RGCs标识率与F组无显著性差异（P>0.05）。结论hUCBSC移植入视神经损伤大鼠视网膜中可减缓RGCs的凋亡,对RGCs具有一定的保护作用,其与神经营养因子作用强度相仿,而hUCBSC+神经营养因子保护作用最强,且玻璃体腔注射法效果最佳。目的探讨人脐血干细胞（hUCBSC）移植在大鼠视神经损伤后对受损视网膜节细胞保护的机制。方法将36只健康成年S-D大鼠随机分为A组（hUCBSC移植组）和B组（对照组）。每组18只大鼠,两组各取15只制成视神经部分损伤大鼠模型,左眼为损伤眼。另3只作为正常眼进行组内的对照,A组损伤眼玻璃体腔注射hUSBSC悬液（106个）,B组损伤眼注射同等体积PBS,两组分别于治疗后3d、7d、14d、21d、28d（每个时间段3只大鼠,另外3只作为移植前正常大鼠）采用半定量RT-PCR方法检测BDNF、GDNF mRNA在视网膜内的表达水平。结果hUCBSC移植后A组（hUCBSC移植组）与B组（对照组）相比,除第1周视网膜内表达BDNF无明显差别外,余时间段BDNF、GDNF在视网膜内分泌水平A组均明显高于B组。移植组BDNF表达一直呈升高趋势,特别是在14d后,升高更加明显.；而移植组GDNF表达21d升高至高峰,28d时也有下降。表明hUCBSC移植后在视网膜内持续分泌BDNF及GDNF。结论hUCBSC在视神经损伤大鼠视网膜内可持续分泌神经营养因子BDNF及GDNF,弥补视神经损伤后维持节细胞生存所匮乏的营养因子,这可能是hUCBSC对视神经损伤后节细胞保护及神经修复的重要机制之一。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 大鼠外伤性视神经损伤模型的建立
• 1. 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 统计学分析
• 3. 结果
• 3.1 视网膜神经节细胞计数与标识率
• 3.2 HE染色组织病理改变
• 4. 讨论
• 4.1 视神经损伤的动物模型
• 4.2 RGCs逆行标记方法
• 5. 结论
• 附图
• 第二章 人类脐血干细胞移植对大鼠外伤性视神经损伤的疗效研究
• 1. 前言
• 2. 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3. 结果
• 3.1 视网膜神经节细胞计数与标识率
• 3.2 HE染色组织病理改变
• 4. 讨论
• 4.1 人脐血干细胞
• 4.2 人脐血干细胞移植治疗外伤性视神经损伤
• 5. 结论
• 附图
• 第三章 人类脐血干细胞在大鼠外伤性视神经损伤模型中作用机制的研究
• 1. 前言
• 2. 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 统计方法分析
• 3. 结果
• 3.1 损伤后注hUCBSC组,损伤后注PBS组组内比较
• 3.2 损伤后注hUCBSC组及损伤后注PBS组组间比较
• 4. 讨论
• 4.1 人脐血干细胞及神经营养因子对中枢神经系统损伤的保护作用
• 4.2 神经营养因子对RGCs保护作用
• 4.3 人脐血干细胞移植后在视网膜内分泌BDNF及GDNF
• 5. 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 攻读博士学位期间主要研究成果