论文摘要
研究背景多糖是中药中一类天然高分子化合物,是维持生命正常运转的基本物质,有调节免疫系统功能、抗氧化以及抗衰老等作用,具有巨大开发潜力。近年来,多糖的研究引起了国内外许多学者极大的兴趣。多糖不但能治疗机体的免疫系统受到严重损伤的肿瘤,而且能治疗多种免疫缺损疾病,其免疫疗法已经给近代肿瘤、艾滋病及其它疾病的治疗开辟了新的方向。此外,由于分子生物学和分析新技术的高速发展,活性多糖的分离和分析手段也取得了很大的进展。丹参Salvia miltiorrhiza Bge.是唇形科鼠尾草属植物,以根及根茎入药,为我国传统中药材,可用于治疗冠心病、中风、微循环障碍等疾病。丹参最早记载见于《神农本草经》,性味苦、微温,有活血祛瘀,安神宁心,排脓,止痛的功效,被列为上品。现代研究表明,丹参是著名的活血化瘀良药,临床广泛用于治疗冠心病、心绞痛、心肌梗塞和脑血管疾病,疗效确切。丹参中脂溶性有效成分为丹参酮类,具有抗菌作用；水溶性有效成分为酚酸类,具有抗氧化、改善心肌缺血等药理作用。目前对于丹参活性成分的研究仅限于以上两类小分子物质,而对于极具开发前景的活性多糖及糖蛋白类物质的研究报道较少。研究目的丹参多糖是近年来才开始研究的丹参有效部位之一。课题组前期对丹参多糖的提取工艺进行了研究和优化,现已能够提取含量高、活性强的丹参多糖,对其药理作用的进一步研究表明丹参多糖具有显著的抗免疫性肝损伤的作用,而且在一定浓度范围内存在剂量依赖性。在上述研究的基础上,拟将丹参多糖作为一个免疫增强剂来开发,深入研究其精制工艺,完成部分临床前研究。同时为了进一步开发利用丹参资源,本课题选取丹参为材料,采用现代分离分析技术对丹参多糖组分进行了分离、纯化,并采用现代功能评价方法对小鼠的免疫调节活性进行了初步研究。实验方法及结果1.丹参药材经过水提醇沉、真空干燥即得水溶性粗多糖（SMPc）。采用苯酚硫酸法测定丹参总多糖的含量,考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量。结果显示,葡萄糖在0～80μg·mL1范围内线性关系良好,回归方程为Y=105.26X-1.2998（R2=0.9971）；蛋白浓度在0～0.1μmg·mL-1之间时,与吸光度呈良好的线性关系,回归方程为Y=167.62X-1.4735（R2=0.9991）。结果表明,本方法精密度高、重现性好,可用于丹参总多糖与蛋白质的含量测定。检测发现粗丹参多糖中,多糖含量为40.35%、蛋白质含量为8.96%。2.采用Sevag法、三氯乙酸法对丹参多糖进行除蛋白处理,通过比较不同方法处理后的蛋白含量及多糖含量来确定最佳的除蛋白工艺条件。正交实验优选Sevag法脱蛋白的最佳条件是：料液比为1：1,氯仿与丁醇的配比为4：1,振摇40 min,重复操作次数为5次,此条件下蛋白质去除率为48.65%,多糖保存率为78.6%。三氯乙酸法（4 mol·L-1）的最佳浓度为5%（v/v）,此时其蛋白脱除率为52.30%,多糖保存率为87.57%。实验结果表明,三氯乙酸法除蛋白效果优于Sevag法。3.采用大孔树脂法及离子交换层析柱法精制纯化粗多糖,综合比较D-101、AB-8、DB-301及MG-1等4种大孔吸附树脂对粗多糖的分离纯化效果,进一步以DEAE-52离子交换层析法对过AB-8柱制备得到的粗多糖进行分离精制,经4种大孔树脂初步纯化后发现AB-8、DB-301型的树脂脱蛋白效果好,脱蛋白效率高,纯化后多糖含量分别可达78.72%、80.45%。总多糖经DEAE-52树脂进一步分离纯化得到SMP1、SMP2、SMP3三个组分。结果表明,AB-8、DB-301型大孔吸附树脂及DEAE-52型树脂可应用于丹参多糖的精制纯化。4.将60只KM小鼠随机分为空白对照组、模型Cy组（75 mg·kg-1）、Cy+香菇多糖片（10mg·kg-1）阳性组,Cy+丹参多糖高剂量组300mg·kg-1)、Cy+丹参多糖中剂量组（200mg·kg-1）+Cy和Cy+丹参多糖低剂量组（100mg·kg-1）共6组,在给药10天后,进行碳粒廓清实验,并计算脏器指数、吞噬指数和吞噬系数,观察丹参多糖对CY诱导的免疫低下小鼠相关免疫脏器及网状内皮系统吞噬功能的影响。从实验结果看出：（1）丹参多糖对小鼠脏器系数的影响：①与正常组比较,Cy模型组的胸腺系数、脾脏系数显著降低（P<0.05）。显示Cy可引起免疫器官萎缩,表明建立小鼠免疫抑制模型成功。②与模型组比较,丹参粗多糖3个剂量组的脾脏系数均有显著提高（P<0.05）,但与正常组比较,此3组则均无显著差异（P>0.05）。表明丹参多糖各剂量组均可对抗Cy引起的脾萎缩,使脾脏系数上调。③丹参多糖中、高剂量组的胸腺系数与模型组比较显著上调（P<0.05）,同正常组比较则无显著性差异（P>0.05）。表明丹参多糖各剂量组均可对抗Cy引起的胸腺萎缩,使胸腺系数上调。（2）丹参多糖对小鼠网状内皮系统吞噬功能影响：①与正常组比较,Cy模型组中廓清指数K及吞噬指数α均显著降低（P<0.05）。表明Cy能显著降低小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能,造模成功。②与模型组比较,阳性药组的K、α值均显著上调（P<0.05）,但与正常组比则无显著差异（P>0.05）。表明阳性药香菇多糖可使免疫功能抑制小鼠的吞噬功能上调。③丹参多糖低剂量、中剂量组的K、α值与模型组比较均显著上调（P<0.05）,与正常组比较则无显著差异（P>0.05）。表明丹参多糖低、中剂量组可使免疫抑制小鼠的吞噬功能上调。高剂量的吞噬系数α、吞噬指数K与模型组比较无显著性差异（P>0.05）,作用随着剂量的增加而有一定的减弱。5.通过丹参多糖对免疫抑制小鼠血清中IL-2、IL-10、IFN-γ的影响研究,进一步探讨丹参多糖对小鼠的免疫调节作用。取80只健康NIH小鼠随机分为正常对照组、模型Cy组、Cy+阳性对照组、Cy+粗多糖（SMPc）小剂量、Cy+粗多糖大剂量组（100、300 mg·kg-1）, Cy+丹参纯多糖（SMP）低剂量、Cy+纯多糖中剂量、Cy+纯多糖高剂量组（100、200、300 mg·kg-1）,共8组,每组10只。正常对照组,每天灌胃生理盐水1次,0.2ml/10g,连续给药10 d。除正常对照组外其余各组分别于第1-4 d腹腔注射75 mg·kg-1新配制的环磷酰胺生理盐水,0.1ml/10g,并从第1天起灌胃给药予以干预：模型组每天灌胃生理盐水1次,阳性对照组每天灌胃10 mg·kg-1香菇多糖液1次,丹参粗多糖（SMPc）大、小剂量组每天灌胃300 mg·kg-1、100 mg·kg-1粗多糖液1次,丹参多糖（SMP）高、中、低剂量组分别每天灌胃300 mg·kg-1、200 mg·kg-1、100 mg·kg-1丹参多糖溶液1次,均连续给药10 d。末次用药后,各组小鼠摘眼球取血,静置后取血清,采用ELISA法对小鼠血清进行IL-2、IL-10、IFN-γ细胞因子测定。从实验结果看出：（1）丹参多糖对免疫抑制小鼠血清IL-2的影响：①与正常组比较,Cy模型组血清IL-2显著下调（P<0.05）。显示Cy能显著下调血清IL-2,表明建立免疫抑制模型成功。②与模型组比较,丹参粗多糖组中血清IL-2无显著上调（P>0.05）,且大、小剂量组均低于正常组。表明粗糖对IL-2的上调作用不显著。③丹参纯多糖组血清IL-2与模型组比较均显著上调（P<0.05）,但同正常组比较,低、中剂量组均无显著差异（P>0.05）,而高剂量组与正常组相比较显著上调（P<0.05）。表明纯多糖低、中剂量可使免疫抑制小鼠血清IL-2恢复正常,高剂量可使血清IL-2进一步上调。（2）丹参多糖对免疫抑制小鼠血清IL-10的影响：总体比较无显著差异（P>0.05）,提示这8个处理组小鼠血清IL-10相互比较无统计学意义,即表明丹参多糖对免疫抑制小鼠血清中IL-10无显著的调节作用。（3）丹参多糖对免疫抑制小鼠血清IFN-γ的影响：①与正常组比较,Cy模型组中血清IFN-γ显著下调（P<0.05）。表明Cy能显著下调血清IFN-γ,造模成功。②丹参粗多糖大、小剂量组与模型组比较均无显著上调（P>0.05）。表明丹参粗多糖还不能显著提升血清IFN-γ的含量。③丹参纯多糖低、中、高3个剂量组与模型组比较均有显著上调（P<0.05）,但与正常组比较,3组均无显著性差异（P>0.05）。表明纯糖剂量组可使免疫抑制小鼠血清IFN-γ上调。结论1.在精制纯化工艺研究方面：探讨比较不同大孔树脂对粗多糖的分离纯化效果,AB-8、DB-301型树脂及DEAE-52型树脂的联合运用具有纯化效率高、分离纯度好等特点,可用于丹参多糖的精制纯化。2.丹参多糖免疫活性的初步研究方面：通过丹参多糖对免疫抑制小鼠的干预研究发现：（1）丹参多糖能显著上调CY诱导的免疫低下小鼠的脾指数、胸腺指数、碳粒廓清指数K及吞噬指数α,具有恢复受损免疫器官和提高环磷酰胺诱导免疫低下小鼠巨噬细胞的吞噬功能的作用。（2）丹参多糖能显著上调CY诱导的免疫低下小鼠的IL-2和IFN-y的表达,具有上调相关免疫细胞因子的作用。注：本论文中的所有数据均采用SPSS 16.0。多组间比较采用单向方差分析（One-way ANOVA）,各组均数的多重比较采用最小显著差值法（Least Significant Difference, LSD）:不满足方差齐性要求时,采用Dunnett’s T3法。
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