半胱氨酰白三烯对脑的致损伤作用及其机制研究

论文摘要

目前认为，各种脑损伤（脑缺血、脑外伤）的继发性损伤，或称二次脑损伤因素，是造成脑损害发生、发展的重要原因。这些因素涉及：脑缺血、能量代谢障碍、钙离子超载、氧自由基堆积、兴奋性氨基酸的神经毒作用、炎性因子刺激等。其中，炎症是脑损伤病理生理过程中的一个重要组成环节，半胱氨酰白三烯（cysteinyl leukotrienes, CysLTs，包括LTC4、LTD4和LTE4）是一类重要的炎症介质，是花生四烯酸5-脂氧合酶（5-lipoxygenase, 5-LOX）的代谢产物。CysLTs通过激活半胱氨酰白三烯受体（包括CysLT1和CysLT2受体），参与多种炎症病理过程，介导平滑肌痉挛、微血管渗漏等反应。近年证明，除了在哮喘、过敏性鼻炎等炎症疾病发病过程中起重要作用外，CysLTs也参与脑卒中、脑外伤、脑肿瘤、癫痫等中枢神经系统疾病的病理生理过程。脑缺血后CysLTs释放增加，5-LOX抑制剂能减少CysLTs产生，保护脑缺血性损伤，本实验室也发现，CysLT1受体拮抗剂普鲁司特和孟鲁司特对实验性脑缺血损伤有保护作用，普鲁司特对NMDA引起的皮层损伤及小鼠脑冷冻伤也有保护作用。这些发现均提示CysLTs参与脑损伤病理过程，然而，CysLTs对神经元是否有直接致损伤作用?这种作用通过哪种受体亚型介导?这些问题仍有待阐明。脑损伤是高度复杂的病理过程，而脑水肿是各种脑损伤的共同病理环节。脑水肿一般包括血管性脑水肿和细胞性脑水肿。血管性脑水肿（vasogenic brainedema）是由于血脑屏障通透性增高，导致血浆蛋白渗漏到细胞间隙，造成细胞间隙胶体渗透压增高而导致脑组织肿胀；细胞性脑水肿（cytotoxic brain edema）是由于细胞能量代谢障碍，导致离子泵（如Na+-K+-ATP酶等）转运功能失调，离子蓄积在细胞内而导致细胞肿胀。脑水肿形成的根本原因，在于水分子跨细胞膜转运功能障碍，这种障碍涉及水通道蛋白（aquaporins,AQPs）。AQPs是一组介导水分子跨膜转运的细胞膜蛋白，AQP4是脑内最主要的AQPs亚型。已经发现，包括脑外伤、脑缺血、脑肿瘤等多种脑损伤病理中，伴随脑内AQP4表达上调，而且与脑水肿发生密切相关，对AQP4基因敲除动物的研究结果提示，AQP4对血管性脑水肿和细胞性脑水肿的形成均有影响。在我们的前期工作中，以药理学方法证实CysLTs／CysLT受体参与缺血性脑损伤，其机制与血脑屏障（BBB）破坏、脑水肿发生相关，但是，在脑水肿形成过程中CysLTs与脑内AQP4间是否存在联系，以及与AQP4表达调节有关的CysLT受体亚型等问题，有待于进一步阐明。为深入探讨CysLTs对脑的直接致损伤作用，本研究建立CysLTs小鼠皮层注射模型，考察CysLTs对血脑屏障功能、脑水肿的影响，以及CysLTs引起的神经元变性、死亡和脑梗死等作用；同时，观察CysLT1受体拮抗剂普鲁司特对CysLTs致脑损伤作用的影响。我们还建立了大鼠原代星形胶质细胞LTD4损伤模型，考察LTD4对AQP4表达的调节作用；同时，以普鲁司特和CysLT1／CysLT2受体非选择性拮抗剂BAYu9773干预，以了解与该作用有关的CysLT受体亚型。第—部分外源性半胱氨酰白三烯对小鼠脑皮层的致损伤作用脑损伤引起脑内CysLTs释放增加，CysLT受体诱导表达；5-LOX抑制剂能减少CysLTs产生，减轻脑缺血性损伤；CysLT1受体拮抗剂普鲁司特和孟鲁司特，也可减轻实验性脑缺血损伤。这些结果均表明，CysLTs参与脑损伤过程。为进一步探讨CysLTs对脑的直接致损伤作用及其特征，了解与CysLTs致脑损伤作用有关的受体亚型，我们研究了CysLTs（LTC4、LTD4）小鼠皮层注射致脑损伤的量效关系和时效关系，同时观察了CysLTs引起的BBB功能损害、脑水肿形成、神经元变性、死亡，以及对皮层AQP4表达的影响。结果显示，小鼠皮层注射LTC4、LTD4（＞1ng/0.5μl PBS）均可造成皮层损伤；LTD4（1ng/0.5μl PBS）造成的皮层损伤，发生于注射后6小时，伴随皮层内源性IgG渗出增加，脑水肿形成，同时出现Fluoro-Jade B染色阳性细胞（变性神经元）数量增加，存活神经元计数减少，以及皮层AQP4表达上调。CysLT1受体拮抗剂普鲁司特，能减小LTD4引起的皮层梗死面积，抑制皮层内源性IgG渗出及神经元变性、死亡；但是，不影响LTD4引起的脑水肿和皮层AQP4表达上调。结果表明，CysLTs对小鼠皮层具有致损伤作用，其机制与BBB破坏、脑水肿发生相关；CysLTs通过CysLT1受体介导BBB开放，引起血管性脑水肿，导致脑损伤；CysLTs还可能通过上调AQP4表达引起细胞性脑水肿，而该作用并非由CysLT1受体介导。第二部分白三烯D4对大鼠原代星形胶质细胞水通道蛋白4的调节作用脑内水平衡与水通道蛋白（aquaporins，AQPs）有关。其中，AQP4是脑内最重要的AQP亚型，AQP4主要分布在脑内星形胶质细胞及其突起，也表达在室管膜细胞以及脑血管内皮细胞，是调节脑内水平衡的一种主要机制。脑损伤（脑缺血、脑外伤、脑肿瘤和脑水中毒）可以引起AQP4表达改变，与脑水肿形成密切相关。AQP4基因缺失可以减轻局灶性脑缺血、脑水中毒及细菌性脑膜炎引起的细胞性水肿，但可促进脑肿瘤、脑脓肿，皮层冷冻伤和脑积水引起的血管性水肿形成；提示AQP4对脑血管性水肿具有抑制作用，但促进细胞性水肿形成。在第一部分研究中，我们发现LTD4引起的脑水肿伴随皮层AQP4表达增加，CysLT1受体拮抗剂普鲁司特不影响该作用。为了验证CysLTs对AQP4表达的调节作用，阐明与该作用有关的CysLT受体亚型，我们建立了大鼠原代星形胶质细胞LTD4损伤模型。结果发现，LTD4(10-9-10-7mol／L)使体外培养的大鼠原代星形胶质细胞AQP4表达上调，同时伴随细胞形态改变，作用具有浓度依赖性。研究还发现，大鼠原代星形胶质细胞仅有微量CysLT2受体mRNA表达，而CysLT1受体mRNA表达相对较高，LTD4(10-9-10-7mol／L)对星形胶质细胞CysLT1受体mRNA表达无显著影响，但可浓度依赖性上调CysLT2受体mRNA表达。选择性CysLT1受体拮抗剂普鲁司特、孟鲁司特，对LTD4(10-9-10-7mol／L)引起的AQP4表达上调无显著影响；CysLT1／CysLT2受体非选择性拮抗剂BAYu9773，显著抑制LTD4(10-9-10-7mol／L)引起的AQP4表达上调。这些结果提示，LTD4可上调AQP4表达，并诱导表达星形胶质细胞CysLT2受体；提示炎症过程中释放的CysLTs可通过CysLT2受体促进细胞性脑水肿形成，这可能是CysLTs致脑损伤作用的另一机制。总结1、外源性CysLTs（LTC4、LTD4）对小鼠脑皮层具有时间和剂量依赖的致损伤作用，其机制与血脑屏障破坏相关。CysLT1受体拮抗剂普鲁司特对CysLTs引起的血脑屏障破坏和皮层损伤具有保护作用，表明CysLTs通过CysLT1受体诱导血管性脑水肿，导致脑损伤。2、外源性LTD4引起小鼠脑皮层AQP4表达上调和脑水肿；普鲁司特对LTD4引起的AQP4表达上调和脑水肿无抑制作用。3、外源性LTD4浓度依赖性上调大鼠原代星形胶质细胞AQP4表达；CysLT1受体拮抗剂普鲁司特、孟鲁司特对LTD4引起的AQP4表达上调无明显作用，但CysLT受体非选择性拮抗剂BAYu9773可阻断这种上调；LTD4还可浓度依赖性上调CysLT2受体mRNA表达。表明LTD4可通过激动CysLT2受体调节AQP4表达，引起细胞性脑水肿。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 第一部分:外源性半胱氨酰白三烯对小鼠脑皮层的致损伤作用
• 前言
• 材料
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 第一部分小结
• 参考文献
• 4对大鼠原代星形胶质细胞水通道蛋白4的调节作用'>第二部分:白三烯D₄对大鼠原代星形胶质细胞水通道蛋白4的调节作用
• 前言
• 材料
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分小结
• 参考文献
• 结论
• 综述
• 已发表论著
• 致谢