MhGAI2基因在番茄中的异位表达分析

论文摘要

赤霉素(gibberellic acid,GA)调控植物生长发育的各个方面,包括种子萌发、下胚轴伸长、叶片生长和开花等。DELLA蛋白的N端具有高度保守的DELLA结构域,该结构域在GA信号诱导的DELLA蛋白降解过程中起关键作用。若DELLA结构域或上下游的重要氨基酸序列发生改变,DELLA蛋白就不能响应GA信号发生降解,表现为对GA信号不敏感,从而抑制植物生长发育。从平邑甜茶中扩增了DELLA蛋白编码基因MhGAI2,通过搭桥PCR对其DELLA结构域编码序列进行定点突变,获得MhGAI2的GA不敏感型等位基因ΔMhGAI2。用ΔMhGAI2基因遗传转化番茄,获得ΔMhGAI2基因异位表达的转基因番茄,转基因番茄TH和TL株系作为ΔMhGAI2在番茄中的高表达和低表达株系,由于TH和TL的纯合体后代表现对GA极不敏感以及致矮现象严重,因此试验中我们选择的都是半矮化的杂合体研究ΔMhGA2对生长发育的抑制作用。同时,转pBI121空载体的番茄为对照,命名为pBI。表型观察发现,转基因番茄植株矮化,下胚轴、主枝和侧枝节间长度等变短,且表现为GA不敏感。另外,与对照相比,转基因番茄株系的花序更紧凑,花、果实和种子等也都比对照小。干旱逆境处理后,转基因番茄幼苗的抗旱能力明显强于对照。

论文目录

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• 1 引言
• 1.1 赤霉素的发现和分布
• 1.2 赤霉素的生物合成与代谢途径
• 1.3 GA 的信号应答机制
• 1.3.1 GA 信号途径的主要组分
• 1.3.2 GA 受体
• 1.3.3 DELLA 蛋白
• 1.4 DELLA 蛋白与植物的生长发育
• 1.4.1 DELLA 蛋白与植物的形态
• 1.4.2 DELLA 蛋白与环境之间的互作
• 1.5 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 酶及生化试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 PCR 引物
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 CTAB 法提取RNA
• 2.2.2 RNA 含量和纯度检测
• 2.2.3 cDNA 第一链的合成
• 2.2.4 反转录产物质量检测
• 2.2.5 CTAB 法提取DNA
• 2.2.6 PCR 扩增条件和程序
• 2.2.7 PCR 扩增产物的回收
• 2.2.8 PCR 产物的克隆
• 2.2.9 cDNA 序列测定
• 2.2.10 质粒DNA 的酶切鉴定
• 2.2.11 根癌农杆菌LBA4404 感受态细胞的制备与转化
• 2.2.12 点突变正义表达载体p81121-ΔMhGA12 的构建
• 2.2.13 MhGAI2-GFP 亚细胞定位载体构建
• 2.2.14 MhGAI2 基因原核表达载体的构建
• 2.2.15 MhGAI2 原核表达重组菌株的诱导表达及电泳分析
• 2.2.16 农杆菌介导的番茄转化
• 2.2.17 番茄继代培养
• 2.2.18 转基因番茄的鉴定
• 2.2.19 光合色素含量的测定
• 2.2.20 番茄植株外源喷施GA 处理
• 2.2.21 番茄生长数据统计
• 2.2.22 番茄干旱处理
• 3 结果与分析
• 3.1 苹果MhGAI2 基因的扩增
• 3.1.1 RNA 的提取和质量检测
• 3.1.2 反转录产物质量检测
• 3.1.3 MhGAI2 基因的扩增
• 3.2 ΔMhGAI2 定点突变序列分析及表达载体p81121-ΔMhGA12 的构建..
• 3.3 MhGAI2 蛋白的亚细胞定位
• 3.4 MhGAI2 基因的原核表达
• 3.5 ΔMhGAI2 转基因番茄的鉴定
• 3.6 ΔMhGAI2 过量表达番茄植株的GA 响应
• 3.7 ΔMhGAI2 转基因番茄的表型分析
• 3.8 ΔMhGAI2 转基因番茄干旱逆境分析
• 4 讨论
• 4.1ΔMhGAI2 转基因番茄的表型特征
• 4.2ΔMhGAI2 转基因番茄的抗旱特性
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表和形成的学术论文