人谷氨酰半胱氨酸合成酶通过抑制JNK防止紫外刺激诱导的细胞死亡的研究

论文摘要

细胞死亡通路对于胚胎发育和正常组织稳态的维持是必需的。在分子水平,细胞凋亡受到严格的调控。凋亡不足或过量凋亡都会引起各种疾病的发生比如:肿瘤、自体免疫性疾病或神经退行性疾病的发生。因此,细胞凋亡在生物医药科学研究中也已成为重要的研究领域。对凋亡信号通路及其调节机制的研究为各种疾病的治疗提供了新的思路。 为研究谷胱甘肽合成酶类谷氨酰半胱氨酸合成酶对紫外诱导的HEK293细胞死亡的影响,本实验分为以下两部分: 一:谷胱甘肽合成酶类基因的克隆与诱导表达 通过PCR技术从人cDNA库中扩增出GCLC（谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚基）和GSS（谷胱甘肽合成酶）,并分别将他们插到真核和原核质粒的MCS位点中。利用这些重组载体的构建能够为下一步研究GCLC对紫外刺激诱导细胞凋亡影响做好基础。构建的原核重组载体分别用IPTG进行诱导表达能够得到大量表达的目的蛋白,也可为两种蛋白抗体的制备做好准备,从而在将来的工作里能够有效的检测到内源和外源蛋白表达的变化。 二:人谷氨酰半胱氨酸合成酶防止紫外刺激诱导HEK293细胞死亡的机制研究 人的谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）是谷胱甘肽合成的限速酶,而GCLC具有γ-GCS所有的催化活性。从形态上观察GCLC能够显著地抑制紫外刺激诱导的HEK293细胞的死亡。MTS实验和FACS检测的结果也表明GCLC和JNK1APF的表达能够提高细胞对紫外刺激的耐受性。通过Western blotting技术检测到UV能够强烈的激活JNK、p38和caspase-3。有趣的是,检测结果表明GCLC能够抑制UV诱导的JNK1的磷酸化,而对p38的磷酸化没有任何影响。因此,大量表达GCLC能够保护HEK293细胞免受紫外刺激诱导的细胞死亡主要是通

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 一、细胞死亡的方式及紫外刺激诱导的凋亡通路的研究进展
• 1.细胞死亡的方式
• 2.紫外刺激诱导的细胞凋亡通路的研究进展
• 二、谷胱甘肽与谷氨酰半胱氨酸合成酶
• 1.谷胱甘肽
• 2.谷氨酰半胱氨酸合成酶
• 三、展望
• 第一章 谷胱甘肽合成酶类基因的克隆与诱导表达
• 1.实验材料
• 1.1 菌种和质粒
• 1.2 试剂
• 1.3 主要实验仪器
• 2.实验方法
• 2.1 谷胱甘肽合成酶类真核表达载体构建
• 2.2 谷胱甘肽合成酶类原核载体构建
• 3.实验结果
• 3.1 谷胱甘肽合成酶类真核表达载体构建
• 3.2 谷胱甘肽合成酶类原核载体构建与诱导表达
• 4.讨论
• 第二章 人谷氨酰半胱氨酸合成酶防止紫外刺激诱导HEK293细胞死亡的机制研究
• 1.实验材料
• 1.1 质粒、细胞与培养基
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要实验仪器
• 2.实验方法
• 2.1 细胞培养与紫外处理
• 2.2 Western印迹分析
• 2.3 荧光素酶报告基因的检测
• 2.4 胞内还原型谷胱甘肽水平的测定
• 2.5 细胞毒性检测与流式细胞仪法测定细胞凋亡率
• 3.实验结果
• 3.1 GCLC对紫外刺激后的细胞的保护作用
• 3.2 GCLC对紫外刺激的细胞的谷胱甘肽水平的影响
• 3.3 GCLC对紫外刺激下胞内的MAPK激酶的影响
• 3.4 GCLC对p21转录活性的影响
• 3.5 GCLC对紫外刺激后胞内caspase-3的影响
• 4.讨论
• 结论
• 参考文献
• 符号、缩略语等专用术语注释表
• 附录
• 致谢