水稻OsSEC18和OsVPS37基因的功能研究

论文摘要

水稻是植物生物学研究中重要的模式作物,也是主要的粮食作物。蛋白质转运过程在生物的整个生命过程中都起着重要作用,尤其对于粮食作物来说,蛋白转运途径对种子中蛋白质的积累和粮食产量有着重要的影响。蛋白转运途径中有两个重要的事件,囊泡融合和泛素化货物蛋白的降解。目前对这两方面的研究集中在酵母和哺乳动物细胞中,在植物细胞里囊泡融合和货物蛋白降解的机制还有很多未知领域。本论文包含两个课题,分别探讨了囊泡融合和货物蛋白降解途径中两个关键基因OsSEC18基因和OsVPS37基因在水稻中的生物学功能。主要结果如下：1、本研究通过凝胶过滤实验发现OsSec18蛋白在水稻胚乳细胞里形成一个大小约为290kDa的复合体,通过质谱测序发现该复合体内包括Os60sP0蛋白,且这两个蛋白的相互作用可经酵母双杂交实验证实。免疫共沉淀的结果显示OsSecl8蛋白是和游离的Os60sP0蛋白相互作用的。2、通过序列缺失分析证实,OsSec18蛋白N端1～260氨基酸区域和C端470～744氨基酸区域可以和Os60sP0蛋白相互作用,并且Os60sP0蛋白N端1～128氨基酸区域和C端215～320氨基酸区域可以和OsSec18蛋白相互作用。3、通过转基因研究发现,OsSEC18基因的过表达导致植株矮小,在组织水平上,叶片组织细胞形态变小且细胞与细胞之间排列更为紧密。由于Os60sP0蛋白参与人乳腺癌和肝癌细胞增殖,由此我们推测OsSecl8蛋白同Os60sP0蛋白的相互作用是导致OsSEC18基因过表达株系表型的分子机理。4、本研究利用OsVPS37基因的cDNA全长筛选水稻叶片cDNA细菌双杂交文库,得到OsVps37蛋白的相互作用蛋白谷氨酰胺合成酶GS1-1。5、通过酵母双杂交系统验证OsVps37蛋白和OsGS1-1蛋自在体外可发生相互作用,进而分析这两个蛋白的相互作用区域,发现OsVps37蛋白N端1-76氨基酸和C端142～234氨基酸区域可以和OsGS1-1蛋白结合,而OsGS1-1蛋白N端1-90氨基酸区域可以和OsVps37蛋白相互作用。6、利用免疫共沉淀技术和凝胶过滤技术证实OsVps37蛋白和GS1-1蛋白在体内也可以相互作用,并OsVps28蛋白参与此相互作用。通过酶活性检测显示当过表达OsVPS37基因和OsVPS28基因时,GS-GOGAT通路上相关酶活性有不同程度的升高。7、烟草悬浮细胞BY2瞬时表达实验显示OsGS1-1蛋白影响ESCRT-I复合体的细胞定位,推测ESCRT-1复合体参与OsGS1-1蛋白的运输。8、根据上述结果,OsVPS37基因参与了氮素循环利用中谷氨酰胺合成酶OsGS1-1蛋白的功能,这一发现为提高氮素的利用率提供新的研究方向。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 蛋白质转运概述
• 1.1 蛋白质转运网络的组成
• 1.1.1 内质网
• 1.1.2 高尔基体
• 1.2 蛋白质运输和储存的场所—各种小泡和囊泡
• 1.2.1 蛋白质在ER和高尔基之间的运输小泡-CCV、COPI、COPII
• 1.2.2 蛋白质储存的场所—LV和PSV
• 1.2.3 MVB
• 1.3 囊泡分选信号（Vacuolar sorting signals）和受体（recptors）
• 1.3.1 囊泡分选信号
• 1.3.2 囊泡受体（vacuolar sorting receptors,VSR）
• 1.4 蛋白转运到囊泡的多种途径
• 1.4.1 ER-Golgi途径
• 1.4.2 ER-Golgi-CCV-LV途径
• 1.4.3 ER-Golgi-DV-PSV途径
• 1.4.4 ER-PAC-PSV
• 2 SNARE蛋白和膜融合
• 2.1 SNARE蛋白的发现
• 2.2 SNAREs蛋白的结构
• 2.3 SNAREs蛋白的分类
• 2.3.1 SNAREs蛋白的功能分类
• 2.3.2 SNAREs蛋白的结构分类
• 2.4 SNARE复合体的结构
• 2.5 SNAREs在小泡介导的蛋白转运中的功能
• 2.6 SNARE诱导膜融合的分子机制
• 2.7 已知的SNARE复合体
• 2.8 SNARE功能的调控因子
• 2.8.1 NSF和α-SNAP
• 2.8.2 Sec1/Munc18相似（SM）蛋白
• 2.8.3 Munc13s
• 2.8.4 Complexins
• 2.8.5 Synaptotagmin Ⅰ
• 3 ESCRTs蛋白和ESCRT复合体及其功能
• 3.1 ESCRT-0复合体
• 3.2 ESCRT-Ⅰ复合体
• 3.3 ESCRT-Ⅱ复合体
• 3.4 ESCRT-Ⅲ复合体
• 3.5 Vps4-Vta1复合体
• 3.6 ESCRT和其他分子的相互作用及功能结构域
• 3.6.1 ESCRT-泛素相互作用
• 3.6.2 ESCRT-脂质相互作用
• 3.6.3 MIT结构域和MIT-相互作用元件
• 3.6.4 Bro1结构域
• 3.7 ESCRTs的细胞内功能
• 3.7.1 ESCRTs在MVB生物合成和受体负调控上的作用
• 3.7.2 ESCRTs从高尔基分选囊泡和溶酶体蛋白
• 3.7.3 向内的膜断裂生成内膜小泡
• 3.7.4 ESCRTs和细胞分裂
• 3.7.5 ESCRTs和病毒出芽
• 3.7.6 去泛素化
• 3.7.7 ESCRTs和细胞自我吞噬
• 3.8 植物里的ESCRT蛋白和ESCRT途径
• 第二章 水稻NSF同源基因OsSEC18基因功能的研究
• 1 前言
• 1.1 NSF蛋白的结构和功能
• 1.2 植物中SEC18基因的研究现状
• 1.3 核糖体酸性蛋白P0（ribosomal acidic P0 protein）的功能
• 2 实验材料与方法
• 2.0 本课题实验材料
• 2.1 本课题实验中所需质粒构建
• 2.2 蛋白质提取、SDS-PAGE电泳和免疫印迹
• 2.3 凝胶过滤层析实验
• 2.4 蛋白质MALDI—TOF质谱（基质辅助激光解析电离飞行时间质谱）分析
• 2.5 酵母双杂交实验
• 2.6 免疫共沉淀
• 2.7 植物组织材料切片
• 3 实验结果和讨论
• 3.1 转OsSEC18基因水稻植株表型分析
• 3.2 水稻胚乳OsSec18蛋白复合体的鉴定
• 3.3 OsSec18蛋白和Os60sP0蛋白体外相互作用区域
• 3.4 OsSec18蛋白和Os60sP0蛋白在体内也可相互作用
• 3.5 OsSec18蛋白和游离的Os60sP0蛋白相互作用
• 3.6 OsSEC18基因对水稻生长发育的影响
• 4 本章小结
• 第三章 水稻OsVPS37基因功能的研究
• 1 前言
• 1.1 Vps37蛋白的功能
• 1.2 水稻OsGS1-1蛋白的功能
• 2 实验材料和方法
• 2.1 本课题实验材料
• 2.2 本课题所需质粒的构建
• 2.3 基因枪法BY2细胞瞬时表达
• 2.4 酶活性检测
• 3 实验结果和讨论
• 3.1 OsVps37蛋白可以和OsGS1-1蛋白相互作用
• 3.2 OsVps28蛋白参与OsVps37蛋白和OsGS1-1蛋白的相互作用
• 3.3 OsVPS37基因和OsVPS28基因影响GS-GOGAT通路相关酶活性
• 3.4 OsVps37蛋白和OsGS1-1蛋白的作用方式
• 4 小结
• 参考文献
• 在读期间发表及待发表的论文
• 致谢