农杆菌介导的多年生黑麦草的遗传转化

论文摘要

草坪草在人类生活中的作用日益突出,对其进行品种培育和改良也成为当今世界的一项重要工作。由于传统育种手段有很大的局限性,利用基因工程培育和改良草坪草品种是一种便捷和实用的途径,也是草坪草育种研究的必然趋势。多年生黑麦草是国内外广泛应用的重要冷季型草坪草之一,利用植物基因工程技术改良其除草剂抗性及抗虫性,不仅可以减少化学除草剂及化学杀虫剂的使用,保护环境,节约草坪维护费用,而且对于保持草坪的观赏性也有重要作用。目前,黑麦草的遗传转化方法主要有基因枪法、硅碳纤维法、原生质体直接转化法及农杆菌介导法。本实验对黑麦草的组织培养和植株再生进行了研究,通过农杆菌介导的方法进行黑麦草的遗传转化,已获得转抗除草剂基因的多年生黑麦草植株和转抗虫基因的多年生黑麦草植株。主要研究内容如下:（1）以多年生黑麦草Dt808011的成熟胚为外植体,在MS培养基中附加5mg/L 2,4-D,诱导胚性愈伤组织效果较好,胚性愈伤组织的诱导率可达15.1%。在分化培养基中添加一定浓度的6-BA,有助于愈伤组织的分化,6-BA浓度为1 mg/L时愈伤组织的分化率较高,建立了高效的黑麦草成熟胚再生体系。（2）研究了农杆菌浸染黑麦草的遗传转化效率的影响因素,优化了转化条件:以继代5-10天的胚性愈伤组织为受体,农杆菌浸染液浓度OD660=1.0,添加100mg/L的乙酰丁香酮,在0.5×105Pa负压下真空处理5min,浸染时间控制在30min以内。gus基因瞬间表达分析表明,此条件下获得的阳性愈伤组织比例较高,可达54.32%。（3）转基因植株的获得。构建表达载体p3301-Ubi8c,p3301-Ubi8e和p3301-Ubi8g。分别将pDM805（含抗除草剂bar基因）和上述3个抗虫基因（cry8C、cry8E和cry8G）的质粒载体,导入根癌农杆菌AGL1。通过农杆菌介导法转化黑麦草愈伤组织,得到转基因植株,经过PCR、GUS组织染色及Basta抗性实验检测,117株转基因植株中有61株为含bar基因的阳性植株,转基因植株阳性率约为52.1%;3个抗虫基因的部分转化植株经PCR检测,也得到了含有外源基因的阳性株系。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1. 引言
• 2. 黑麦草转基因技术的研究进展
• 2.1 黑麦草遗传转化的受体系统
• 2.1.1 愈伤组织培养
• 2.1.2 悬浮细胞培养
• 2.1.3 原生质体培养
• 2.1.4 花药培养
• 2.1.5 茎尖分生组织培养
• 2.2 黑麦草的遗传转化方法
• 2.2.1 原生质体直接吸入方法
• 2.2.2 硅碳纤维介导的直接基因转化
• 2.2.3 基因枪轰击法
• 2.2.4 农杆菌介导法
• 2.3 转基因草坪草外源基因的表达和鉴定
• 3. 草坪地下害虫蛴螬的危害及防治
• 3.1 蛴螬的危害
• 3.2 蛴螬的防治
• 4. 苏云金芽孢杆菌cry8 类基因的研究
• 4.1 Bt 杀虫晶体蛋白及其分类
• 4.2 cry8 类基因的研究
• 4.3 转Bt 基因植物的研究进展
• 4.3.1 转Bt 基因植物概述
• 4.3.2 提高外源抗虫基因在植物体内的表达
• 4.3.3 防止害虫产生抗性的策略
• 5. 利用转基因技术对草坪草除草剂抗性的改良
• 6. 草坪草遗传转化中存在的主要问题和展望
• 7. 本实验的研究目的和意义
• 第二章 黑麦草成熟胚离体再生体系的建立
• 1. 材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 培养基
• 2. 方法
• 2.1 黑麦草种子的消毒
• 2.2 愈伤组织的诱导与继代
• 2.3 胚性愈伤组织的继代
• 2.4 植株的再生
• 2.5 炼苗和移栽
• 2.6 除草剂梯度筛选实验
• 2.7 数据处理
• 3. 结果与分析
• 3.1 不同2,4-D 浓度对愈伤组织的诱导及状态的影响
• 3.2 不同浓度的6-BA 对愈伤组织分化的影响
• 3.3 再生植株的生根和移栽
• 3.4 筛选剂浓度测定实验
• 第三章 农杆菌介导的黑麦草的遗传转化及分子鉴定
• 1. 材料
• 1.1 所用植物材料及菌株
• 1.2 质粒载体的构造
• 1.3 主要试剂
• 1.4 培养基
• 2. 方法
• 2.1 表达载体的构建
• 2.1.1 基因片段的扩增
• 2.1.2 基因片段（8c、8e、89）的测序
• 2.1.3 双元表达载体的构建
• 2.2 质粒的提取及浓度的测定
• 2.3 农杆菌感受态细胞的制备
• 2.4 双元载体转化农杆菌
• 2.5 农杆菌介导的黑麦草的遗传转化
• 2.5.1 方法
• 2.6 β-葡糖醛酸糖苷酶（gus）基因表达分析
• 2.6.1 β-葡糖醛酸糖苷酶（gus）基因的瞬时表达分析
• 2.6.2 β-葡糖醛酸糖苷酶（gus）基因在转基因植株中的表达分析
• 3. 转基因植株的分子鉴定
• 3.1 黑麦草基因组DNA 的提取
• 3.2 转基因植株的PCR 检测
• 4. 结果与分析
• 4.1 表达载体的构建
• 4.2 不同菌液浓度对gus 基因瞬时表达的影响
• 4.3 黑麦草转基因植株的PCR 检测
• 4.4 转基因黑麦草植株中β-葡糖醛酸糖苷酶（gus）基因的表达分析
• 4.5 转基因植株的除草剂抗性实验
• 第四章 讨论
• 1.1 外植体的选择
• 1.2 生长激素2,4-D 对愈伤组织状态的调控作用
• 1.3 6-BA 对愈伤组织分化的作用
• 1.4 农杆菌转化条件的优化及增强抑菌效果
• 1.5 选择剂的选用
• 第五章 结论和后继工作
• 1.1 结论
• 1.2 后继工作
• 参考文献
• 附录 主要药品母液及贮存液配制
• 致谢
• 个人简历