小菜蛾对多杀菌素的抗性机理

论文摘要

小菜蛾Plutella xylostella（L.）隶属鳞翅目（Lepidoptera）菜蛾科（Plutellidae）,主要为害十字花科植物,是十字花科蔬菜的主要害虫之一,每年都给全球蔬菜生产造成巨大的损失。据估计,全球每年用于防治小菜蛾的费用高达10亿美元。同时,小菜蛾也是抗药性发展最为严重的害虫之一,已对大约50余种杀虫剂产生了不同程度的抗药性,几乎涉及到所有的防治用药。多杀菌素（spinosad）是新型大环内酯类化合物,作用机制独特,被广泛用于防治抗性小菜蛾。本文通过室内筛选抗多杀菌素小菜蛾品系,研究了小菜蛾对多杀菌素的抗性机理及交互抗性,以期为抗性治理提供科学依据。1小菜蛾对多杀菌素的抗性筛选及交互抗性用多杀菌素对采自深圳田间的小菜蛾在室内进行30代的连续筛选,得到一个抗性品系SZ-Spin56。该抗性品系与敏感品系ROTH和对照品系SZ相比,对多杀菌素的抗性分别上升了170.3倍和65.9倍,而对阿维菌素、茚虫威、高效氯氰菊酯、氟虫腈、杀螟丹、虫满腈、氰氟虫腙、虫酰肼和定虫隆的抗性没有上升,说明抗多杀菌素的小菜蛾对这些杀虫剂没有交互抗性。在对小菜蛾的田间防治中,可以合理轮用或混用这些杀虫剂,以延缓小菜蛾对多杀菌素的抗性,延长多杀菌素的使用寿命。2小菜蛾对多杀菌素的抗性遗传方式分析以敏感品系ROTH和抗多杀菌素品系SZ-Spin56为亲本进行正、反交和回交,分析了小菜蛾对多杀菌素的抗性遗传方式。正交和反交后代的抗性分别为11.1倍和10.5倍,且两者的LC50值没有显著差异,表明抗性为常染色体遗传。正交显性度为-0.06,反交显性度为-0.08,二者皆接近于0,说明抗性为半显性遗传。F1代与SZ-Spin56抗性品系回交后代的LD-P线在死亡率50%处没有明显平坡,适合度检验也证明与单基因假设不相符,表明小菜蛾对多杀菌素的抗性可能为多因子控制。3小菜蛾对多杀菌素抗性的生化机制研究通过活体增效实验和酶活性测定,初步研究了解毒代谢酶在小菜蛾对多杀菌素的抗性形成中的作用。活体增效实验结果表明DEF、DEM和PBO在ROTH敏感品系、SZ对照品系和SZ-Spin56抗性品系中对多杀菌素不存在明显的增效作用。酶活性测定结果表明,SZ对照品系和SZ-Spin56抗性品系的多功能氧化酶活力均高于ROTH敏感品系,但SZ对照品系和SZ-Spin56抗性品系间不存在显著差异。对于谷胱甘肽-S-转移酶活力,以CDNB为底物时,三个品系间没有显著差异;以DCNB为底物时,SZ对照品系和SZ-Spin56抗性品系均高于ROTH品系,但SZ-Spin56抗性品系与SZ对照品系间没有显著差异。SZ对照品系和SZ-Spin56抗性品系的酯酶活力均高于ROTH品系,但SZ-Spin56抗性品系与SZ对照品系间不存在显著差异。这些结果说明小菜蛾对多杀菌素的抗性可能与靶标不敏感性有关,而解毒代谢酶贡献不大。4小菜蛾烟碱型乙酰胆碱受体基因的克隆与分析烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）介导昆虫中枢神经系统中胆碱能突触兴奋性神经递质的快速传递,也是新烟碱类杀虫剂和多杀菌素的作用靶标。本研究利用RT-PCR和RACE技术,克隆了小菜蛾nAChRα亚基Pxa8的全长cDNA序列（GenBank登录号为:EU914853）。Pxa8亚基cDNA序列全长1744bp,开放阅读框为1602bp,编码534个氨基酸,具有nAChRα亚基的典型特征,与其它昆虫nAChRα8亚基具有77%-96%的相似性,与果蝇nAChRβ2亚基具有76%的相似性。Pxa8亚基的开放阅读框存在单核苷酸多态性位点,导致多个位点氨基酸的替换。雌性4龄幼虫的多态性位点多于雄性4龄幼虫,而且雌、雄4龄幼虫的多态性位点均不相同。抗性品系SZ-Spin56的氨基酸多态性位点多于对照品系,并且两品系间的氨基酸多态性位点均不相同。半定量RT-PCR研究结果表明,Pxa8 mRNA在成虫期表达量高于蛹期和4龄幼虫期。本研究结果为进一步研究小菜蛾nAChR亚基的多样性和对多杀菌素的靶标抗性机制提供重要基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 小菜蛾的发生、分布与为害
• 2 小菜蛾的抗药性
• 2.1 小菜蛾抗药性的产生与发展
• 2.2 小菜蛾对不同杀虫剂的抗药性与抗性机制
• 2.2.1 有机磷类杀虫剂
• 2.2.2 氨基甲酸酯类杀虫剂
• 2.2.3 拟除虫菊酯类杀虫剂
• 2.2.4 沙蚕毒素类杀虫剂
• 2.2.5 苯甲酰脲类昆虫生长调节剂
• 2.2.6 微生物杀虫剂Bt
• 2.2.7 阿维菌素及其衍生物
• 2.2.8 植物源杀虫剂
• 3 多杀菌素研究概况
• 3.1 多杀菌素的生物活性
• 3.2 多杀菌素的作用机制
• 3.3 多杀菌素的抗药性研究
• 3.3.1 多杀菌素的抗性与交互抗性
• 3.3.2 昆虫对多杀菌素的抗性遗传方式及抗性机制
• 4 乙酰胆碱受体与昆虫抗药性
• 4.1 乙酰胆碱受体
• 4.2 脊椎动物的烟碱型乙酰胆碱受体
• 4.2.1 烟碱型乙酰胆碱受体亚基类型
• 4.2.2 烟碱型乙酰胆碱受体的分子结构与功能区
• 4.2.3 烟碱型乙酰胆碱受体的门控机理
• 4.3 昆虫的烟碱型乙酰胆碱受体
• 4.4 烟碱型乙酰胆碱受体突变与昆虫的抗药性
• 第二章 小菜蛾对多杀菌素的抗性筛选及交互抗性
• 1 材料与方法
• 1.1 供试昆虫
• 1.2 供试药剂
• 1.3 室内毒力测定方法
• 1.4 抗性筛选方法
• 1.5 交互抗性测定
• 2 结果与分析
• 2.1 抗性筛选及毒力测定
• 2.2 交互抗性测定
• 3 讨论
• 第三章 小菜蛾对多杀菌素的抗性遗传方式分析
• 1 材料与方法
• 1.1 供试昆虫
• 1.2 供试药剂
• 1.3 室内毒力测定方法
• 1.4 小菜蛾对多杀菌素的抗性遗传设计
• 1.4.1 小菜蛾对多杀菌素抗性的显隐性计算
• 1.4.2 单个或多个抗性等位基因的统计估计
• 2 结果与分析
• 2.1 小菜蛾对多杀菌素抗性基因的显隐性分析
• 2.2 抗性遗传的单基因和多基因分析
• 3 讨论
• 第四章 小菜蛾对多杀菌素抗性的生化机制研究
• 1 材料与方法
• 1.1 主要药剂和生化试剂
• 1.2 供试昆虫
• 1.3 供试仪器
• 1.4 增效剂活体增效试验
• 1.5 酶活力测定
• 1.5.1 酶液的制备
• 1.5.2 多功能氧化酶（MFO）活力测定
• 1.5.2.1 以甲基试卤灵为底物（MROD）
• 1.5.2.2 以7-乙氧基香豆素为底物（ECOD）
• 1.5.3 谷胱甘肽-S-转移酶活力（GST）测定
• 1.5.3.1 以1-氯-2,4-二硝基苯（CDNB）为底物
• 1.5.3.2 以1,2-二氯-4-硝基苯（DCNB）为底物
• 1.5.4 酯酶（EST）活力测定
• 1.5.5 蛋白质浓度测定
• 2 结果与分析
• 2.1 活体增效试验
• 2.2 酶活力测定
• 2.2.1 多功能氧化酶（MFO）活力测定
• 2.2.2 谷胱甘肽-S-转移酶（GST）活力测定
• 2.2.3 酯酶（EST）活力测定
• 3 讨论
• 第五章 小菜蛾烟碱型乙酰胆碱受体基因的克隆与分析
• 1 材料与方法
• 1.1 供试昆虫
• 1.2 主要试剂
• 1.3 PCR引物设计
• 1.4 总RNA的提取
• 1.5 第一链cDNA的合成
• 1.6 PCR扩增及产物的纯化、克隆与测序
• 1.7 序列分析与系统发育树的构建
• 2 结果与分析
• 2.1 烟碱型乙酰胆碱受体α亚基cDNA片段的克隆与序列分析
• 2.2 小菜蛾nAChRα亚基Pxα8基因全长cDNA的克隆与序列分析
• 2.2.1 Pxα8基因全长cDNA的克隆
• 2.2.2 小菜蛾nAChR亚基Pxα8基因的系统进化分析
• 2.2.3 Pxα8基因在小菜蛾雌、雄4龄幼虫间的多态性分析
• 2.2.4 Pxα8基因在小菜蛾不同发育阶段的表达分析
• 2.2.5 小菜蛾SZ对照品系和SZ-Spin56抗性品系中Pxα8基因的多态性分析
• 3 讨论
• 3.1 烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）的亚基组成与功能
• 3.2 小菜蛾nAChR α亚基Pxα8与其它昆虫nAChR亚基的相似性与进化关系
• 3.3 昆虫nAChR亚基转录水平上的调控
• 3.4 小菜蛾nAChR α亚基Pxα8的表达情况
• 3.5 烟碱型乙酰胆碱受体突变与昆虫抗药性
• 全文总结
• 参考文献
• 附录:发表的学术论文
• 致谢