毛喉鞘蕊花抗肿瘤有效成分的筛选及其药理药效学研究

论文摘要

毛喉鞘蕊花（Coleus forskohlii Briq.），系唇形科（Labiatae）鞘蕊花属（Coleus Lour）的多年生草本植物。现代药理研究表明，该药用植物对哮喘、急慢性支气管炎、心脏病、肿瘤、青光眼等的均具有良好疗效，因此引起了国内外学者的广泛关注。本课题结合上游分离提取的化学追踪和下游药理药效的生物追踪，筛选出毛喉鞘蕊花的单体活性成分Coleon C（6，11，12，14，16-五羟基松香烷型-5，8，11，13-四烯-7-酮），并在整体动物水平、细胞水平和分子水平三方面探讨其抑制肿瘤细胞增殖的机理，以期寻求得到相对高效而低毒的抗肿瘤新药。通过MTT试验，我们筛选到毛喉鞘蕊花的活性部位Q3并从中分离出天然单体成分Coleon C。结合MTT和克隆形成试验，检测十种人体细胞株对Coleon C的敏感性，发现Coleon C对人肿瘤细胞的毒性明显高于正常细胞，尤其对急性早幼粒白血病细胞HL60和黑色素瘤细胞A375效果最明显。Hoechst 33258荧光染色、DNA片断化和流式细胞术等方法检测结果都说明Coleon C能够诱导这两株肿瘤细胞凋亡。RT-PCR试验结果证明，Coleon C能够下调HL60细胞株Bcl-2基因的转录水平并呈剂量依赖性，同时Bax的转录水平略有提高，使得Bcl-2/Bax的比值降低，从而诱导细胞凋亡。对Coleon C进行小鼠体内的急性毒性试验，测得LD50值为1496±285mg/kg。利用C57BL/6小鼠的Lewis肺癌模型研究Coleon C的体内抗肿瘤活性，结果表明，Coleon C对肿瘤的生长具有明显的抑制作用，80mg/kg的用药组的瘤重抑制率达到45.7±11.3％。上述试验结果表明，Coleon C能低毒高效地引起肿瘤细胞的凋亡，从而在体内和体外都显著抑制肿瘤细胞的增殖，这是有关Coleon C抗肿瘤活性首次研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 抗肿瘤药物市场分析
• 1.1.1 世界及我国癌症发病现状
• 1.1.2 开发抗肿瘤中草药
• 1.2 毛喉鞘蕊花研究概况
• 1.2.1 毛喉鞘蕊花概述
• 1.2.2 毛喉鞘蕊花及鞘蕊属的化学成分
• 1.2.3 毛喉鞘蕊花的药理作用研究概况
• 1.3 癌细胞及其凋亡概述
• 1.3.1 癌细胞的主要特性
• 1.3.2 细胞凋亡的生物学特征
• 1.3.3 细胞凋亡异常与肿瘤发生
• 1.3.4 常用的细胞凋亡检侧方法
• 1.3.5 凋亡相关基因 Bcl-2 家族
• 1.4 研究的目标、内容、创新点和意义
• 1.4.1 研究目标
• 1.4.2 研究内容
• 1.4.3 创新点
• 1.4.4 研究意义
• 第2章 一般实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 细胞株
• 2.1.2 常用试剂
• 2.2 仪器与设备
• 2.3 主要试剂的配制
• 2.4 细胞实验基本操作
• 2.4.1 细胞计数
• 2.4.2 细胞传代
• 2.4.3 细胞冻存
• 2.4.4 细胞复苏
• 2.4.5 琼脂糖凝胶电泳
• 第3章 毛喉鞘蕊花抗肿瘤有效成分的筛选
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 细胞株
• 3.2.2 主要试剂
• 3.2.3 主要仪器设备
• 3.2.4 毛喉鞘蕊花部位和单体化合物的制备
• 3.2.5 MTT 法测细胞活性
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 Q1-Q9 各部位对95-D 细胞存活率的影响
• 3.3.2 Q3 中各单体成分对95-D 和 A375 细胞存活率的影响
• 3.3.3 W1 和 W6 对 A431、MKN45 和 BEL7402 细胞存活率的影响
• 3.3.4 W1 化学结构鉴定
• 3.4 讨论
• 第4章 Coleon C抑制肿瘤细胞增殖
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 细胞株
• 4.2.2 主要试剂
• 4.2.3 主要仪器设备
• 4.2.4 MTT 测 Coleon C 对肿瘤细胞和正常细胞存活率的影响
• 4.2.5 克隆形成试验
• 4.2.6 统计学方法
• 4.3 结果
• 4.3.1 Coleon C 对各种细胞存活率的影响
• 4.3.2 Coleon C 对肿瘤细胞增殖抑制的影响
• 4.4.3 Coleon C 对人黑色素瘤细胞 A375 抑制作用的时效性
• 4.4 讨论
• 第5章 Coleon C抑制肿瘤细胞增殖的作用机制
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 主要试剂
• 5.2.2 主要仪器设备
• 5.2.3 凋亡细胞形态观察——Hoechst 33258 染色
• 5.2.4 流式细胞术——PI 染色法
• 5.2.5 DNA 片段化分析
• 5.2.6 细胞内氧化活性水平原位测定法
• 5.2.7 半定量 RT－PCR 法测定 Bcl-2 基因的转录变化
• 5.2.8 统计学方法
• 5.3 结果
• 5.3.1 ColeonC 对 HL60 和 A375 的细胞核形态的影响
• 5.3.2 流式细胞仪测定 Coleon C 对细胞凋亡的影响
• 5.3.3 Coleon C 对细胞周期的影响
• 5.3.4 DNA 片断化法测凋亡
• 5.3.5 Coleon C 对 HL60 细胞和 A375 细胞内氧自由基水平的影响
• 5.3.6 RT-PCR 检测 Coleon C 对 Bcl-2、Bax 基因转录的影响
• 5.4 讨论
• 第6章 Coleon C体内抗肿瘤活性研究
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 动物
• 6.2.2 主要试剂
• 6.2.3 主要仪器设备
• 6.2.4 急性毒性研究
• 6.2.5 考察体内 Coleon C 对肿瘤生长的作用
• 6.3 实验结果
• 6.3.1 急性毒性实验
• 6.3.2 Coleon C 在体内抑制肿瘤增殖的作用
• 6.4 讨论
• 第7章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 论文发表情况