鬼臼毒素生物转化为鬼臼酸和鬼臼苦素

论文摘要

本文首次建立了鬼臼毒素转化为鬼臼酸和鬼臼苦素的生物转化过程,对该生物转化过程进行了动力学研究和过程优化,提高了该生物转化过程的效率。首先,建立了鬼臼毒素转化为鬼臼酸和鬼臼苦素的生物转化过程。考察了铜绿假单胞菌等十四株微生物对鬼臼毒素的生物转化能力,结果表明,铜绿假单胞菌、芽孢杆菌、红串红球菌、梭状芽孢杆菌、北京棒杆菌、枯草杆菌、噬夏孢欧文氏菌和弯曲假单胞菌等八株微生物对鬼臼毒素具有结构修饰能力,HPLC图谱说明在生物转化过程中有产物产生。铜绿假单胞菌对鬼臼毒素的转化能力最强,转化率达到70.2%,因此选用铜绿假单胞菌进行后续研究。用D312大孔吸附树脂和Sephadex LH-20凝胶柱层析从铜绿假单胞菌生物转化基质中成功地分离得到生物转化产物（1）和（2）。经核磁共振（1H-NMR、13C-NMR）、电喷雾质谱（ESI-MS）和元素分析（Elemental Analysis）等鉴定,生物转化产物（1）和（2）分别确定为鬼臼酸和鬼臼苦素。这是首次利用生物转化方法由鬼臼毒素制备得到对卵巢癌和黑色素瘤具有较好抑制作用的鬼臼酸。然后,对上述建立的生物转化过程进行了动力学研究和过程优化。酵母膏与蛋白胨浓度较高（总浓度≥15 g/L）时,铜绿假单胞菌生长较好（OD600 > 2.5）,但鬼臼毒素转化率低于40%,鬼臼酸浓度低于3 mg/L;酵母膏与蛋白胨浓度较低时（总浓度≤12.5 g/L）,铜绿假单胞菌生长相对较差（OD600≤2.1）,但鬼臼毒素转化率均大于90%（最大值达98.2%）,鬼臼酸浓度介于15～26 mg/L（最大值为25.3 mg/L）。这可能由于铜绿假单胞菌生长的最适条件并不是其生物转化关键酶（如:异构酶和水解酶）合成的最佳条件,而限制性营养条件可刺激异构酶和水解酶的合成。培养基中不添加蔗糖最有利于鬼臼酸的产生（34.3 mg/L）,可能是由于蔗糖的缺乏,鬼臼毒素作为唯一碳源被铜绿假单胞菌利用,因而其转化率较高（98.2%）,并产生较多的鬼臼酸。氯化钠浓度为1 g/L时,鬼臼酸浓度达到较高值47.6 mg/L,鬼臼酸得率为46.5%。一次性添加400 mg/L鬼臼毒素,可以产生29.0 mg/L鬼臼酸,比一次性添加100 mg/L鬼臼毒素产生的鬼臼酸（25.3 mg/L）提高14.6%,但鬼臼酸得率却下降了71.6%,说明一次性添加大量底物不利于鬼臼酸的产生。这可能由于鬼臼毒素的水溶性较差,当一次性添加高浓度的鬼臼毒素（大于120 mg/L）时,鬼臼毒素不能完全溶解,限制了微生物对其的转化。采用底物分批补给方式以解决上述问题,当在生物转化4、10和25小时分别补加100 mg/L底物时,鬼臼酸浓度达到99.9 mg/L,得率为32.1%,相比一次性补加300 mg/L底物（26.0 mg/L,8.5%）,鬼臼酸浓度和得率分别提高284%和278%。将鬼臼毒素作为一种结构新颖的线索性化合物,对其分子结构进行修饰和改造,可以产生分子多样、结构独特的新化合物。本文成功地利用铜绿假单胞菌等八株微生物转化鬼臼毒素得到鬼臼酸和鬼臼苦素,将为鬼臼毒素生物转化的深入研究提供指导,并为其他天然活性先导化合物的生物转化提供借鉴。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 鬼臼毒素简介
• 1.2 鬼臼毒素生物转化研究现状
• 1.3 本研究的主要内容及意义
• 第2章 材料与方法
• 2.1 仪器
• 2.2 鬼臼毒素
• 2.3 微生物菌种
• 2.4 分析方法
• 2.5 生物转化过程的建立
• 2.6 生物转化过程动力学研究和过程优化
• 第3章 结果与讨论
• 3.1 生物转化过程的建立
• 3.1.1 生物催化剂的筛选
• 3.1.2 生物转化产物的分离纯化
• 3.1.3 生物转化产物的结构鉴定
• 3.2 生物转化过程的动力学研究和过程优化
• 3.2.1 生物转化过程动力学
• 3.2.2 氮源对生物转化过程的影响
• 3.2.3 蔗糖对生物转化过程的影响
• 3.2.4 氯化钠对生物转化过程的影响
• 3.2.5 底物补给方式对生物转化过程的影响
• 第4章 总结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 已发表及待发表的论文
• 附图