丹参种质资源收集与评价研究

论文摘要

丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）是唇形科（Labiatae）鼠尾草属多年生草本植物,含有水溶性酚酸类和脂溶性的二萜醌类活性成分,具有活血化淤、清心除烦、消炎、抗病毒、抗肿瘤、抗溃疡等多种重要的药理活性,对心脑血管疾病的治疗作用十分显著。伴随着丹参药材需求的日益扩大和野生资源的逐渐减少,人工种植面积逐年增大。作为常异交植物,其丰富的类型、复杂的性状和广泛的变异给种质的鉴别、评价和利用既提供了条件,又带来了众多困难。因此,综合利用植物学、农学、分子生物学、植物化学和统计学等多学科的技术原理和方法,规范、准确、系统的鉴别并描述丹参种质资源,建立针对其种质特点的评价体系,对于其品质评价、优良种质筛选和高效开发利用丹参资源具有重要意义。本研究以陕西、山东、四川、河南、河北、山西等多个丹参主产地的栽培及野生丹参种质资源为调查对象,参照国家种质资源平台的标准,制定丹参种质描述规范、数据标准及种质描述简表,收集并整理丹参种质资源267份共计12个类型,建立不同丹参种质ISSR分子鉴别体系、有效成分HPLC指纹图谱和体外抗氧化评价体系,从表型和分子水平鉴定和区分相似种质,从生物学性状、农艺性状、有效成分含量3个方面开展不同丹参种质的品质评价,研究种质特殊性状与特征组分之间的关系,为我国丹参种质资源评价、优良品种选育和道地药材品质成因等研究提供一定的理论依据。具体研究内容及结果如下:（1）种质资源数据标准的建立及不同种质的收集:以《植物种质描述规范和数据标准》为依据,制定《丹参种质描述规范和数据标准》,对不同产区丹参生长的地理及环境因子、生物学特性和主要农艺性状进行规范化描述,共收集整理丹参种质资源267份,从形态学、农艺学及有效成分含量上对所收集的种质进行分析评价。（2）不同类型丹参种质生物学及农艺性状观察:系统观察丹参种质生物学及农艺性状,整理并筛选出高产1型,高产2型,高杆型,紫杆型,大叶型,小叶型,浅色叶型,皱面叶型,光面叶型,圆叶型,狭叶形,黄根型共12个类型丹参,并将其移栽于户县、商州和蒲城三个丹参种质资源圃进行性状连续观察与验证,建立每一份种质的数据档案资料（包括实物图像及标本）。观察结果显示,12种类型的丹参种质在叶片形状、叶片大小、叶缘形状、叶色、株高、茎色、茎的一、二级分枝、花色、根粗、根长、单株产量、有效成分含量上有一定的特点,其叶片大小、株高、根长、根粗、单株产量、有效成分含量均具有显著差异（p＜0.05）,可以作为区别和鉴定不同的丹参种质的依据之一。经过综合评价,初步筛选出高产1型和紫杆型丹参两个优良类型,其特点为:产量高、长势好、抗逆性强以及有效成分含量高。（3）不同类型丹参种质有效成分含量的比较:采用高效液相色谱法建立了丹参提取物的指纹图谱,并对不同类型丹参种质根中迷迭香酸、丹酚酸B、二氢丹参酮、隐丹参酮和丹参酮ⅡA五种主要的有效成分进行了定性和定量。结果表明,不同类型丹参种质的有效成分在量上均存在显著差异,其中,高产1型、紫杆型、大叶型和小叶型的丹参的水溶性成分显著高于其它类型（p＜0.05）。另外,皱叶型丹参的脂溶性成分含量显著高于其它类型（p＜0.05）。（4）不同类型丹参种质ISSR分子鉴别:以ISSR分子标记技术构建丹参DNA指纹图谱,采用正交实验设计,通过调整模板DNA浓度,Mg2+浓度,引物浓度,dNTP和Taq酶的含量以及退火温度,将PCR扩增条件调节到最佳状态,并从60条引物中筛选出11条扩增谱带清晰,多态性高的引物,平均每个引物扩增出29.8条带,共扩增出328个条带,312个条带呈多态性,多态性比例为95.1%。采用最小遗传距离算法对聚类结果进行分析,可将参试的12种类型共计84份种质分为两大类群,八个小组,89%的不同类型丹参种质可以单独聚在一起。结果表明,此方法可以从分子水平鉴定并区分不同的丹参种质资源。（5）丹参提取物体外抗氧化评价体系的建立:采用DPPH·自由基清除活性、超氧自由基清除、β-胡萝卜素-亚油酸漂白、铁离子还原抗氧化能力以及DNA损伤保护活性等五种方法,对丹参的叶及根的丙酮和甲醇提取物体外抗氧化能力进行评价。结果显示,丹参叶的甲醇提取物具有较高的DPPH·清除活性和铁还原能力,其抗氧化能力与BHT、VE能力相近。在评价过程中测定了总酚及总黄酮含量,并采用高效液相色谱法测定了不同提取物中丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸和丹酚酸B六种主要的水溶性有效成分。通过抗氧化能力与有效成分之间的相关性分析发现,丹酚酸B在DPPH·清除活性和铁离子还原能力测试中起主要作用,迷迭香酸主要起抑制亚油酸氧化作用。丹参提取物作为一种高效、天然的抗氧化剂在医药及食品领域具有良好的开发前景。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 丹参研究概况
• 1.1.1 药用历史
• 1.1.2 丹参种质资源研究概况
• 1.2 丹参种质资源标准数据制定原则及意义
• 1.3 丹参的化学成分研究进展
• 1.4 丹参有效成分的定量测定研究进展
• 1.5 分子标记研究进展
• 1.5.1 分子标记介绍
• 1.5.2 ISSR分子标记概述
• 1.6 抗氧化研究进展
• 1.7 本论文的研究目的及意义
• 1.8 本论文的技术路线
• 第二章 丹参种质资源调查与评价研究
• 2.1 种质资源收集调查内容及方法
• 2.1.1 收集调查内容
• 2.1.2 收集调查方法
• 2.1.3 种植与考察
• 2.1.4 主要活性成分的含量测定
• 2.2 丹参生态学及生物学特征
• 2.2.1 丹参分布状况
• 2.2.2 丹参分布区的生态环境
• 2.2.3 丹参生物学特点
• 2.3 丹参种质资源数据标准制定原则和标准
• 2.3.1 丹参种质资源描述规范制定的原则和方法
• 2.3.2 丹参种质资源数据标准制定的原则和方法
• 2.3.3 丹参种质资源数据标准表
• 2.4 调查结果
• 2.4.1 不同种质丹参生物学性状比较
• 2.4.2 不同种质丹参的农艺学比较
• 2.4.3 不同种质丹参的主要有效成分含量比较
• 2.4.4 各数据指标基本统计量分析
• 2.4.5 不同丹参种质性状与含量间的相关性分析
• 2.4.6 不同种质丹参的综合评价及初步品种选育
• 第三章 丹参种质资源分子标记研究
• 3.1 供试材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 仪器
• 3.2 研究方法
• 3.2.1 丹参总DNA的提取
• 3.2.2 DNA纯度的检测
• 3.2.3 丹参ISSR-PCR体系的建立
• 3.3 数据收集与统计分析
• 3.3.1 谱带记录
• 3.3.2 聚类分析
• 3.3.3 多样性分析
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 丹参基因组DAN的提取及纯度检测
• 3.4.2 丹参ISSR-PCR体系的优化
• 3.4.3 ISSR多态性分析
• 3.4.4 聚类分析
• 3.5 讨论
• 第四章 丹参提取物的生物活性研究
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 化学试剂
• 4.1.3 材料提取
• 4.1.4 总酚含量测定
• 4.1.5 总黄酮含量测定
• 4.1.6 主要水溶性成分的含量测定
• 4.1.7 抗氧化活性测定
• 4.1.8 DNA损伤活性保护
• 4.1.9 数据分析
• 4.2 结果和讨论
• 4.2.1 总酚和总黄酮含量
• 4.2.2 HPLC分析
• 4.2.3 提取物的抗氧化活性
• 4.2.4 DNA损伤保护效果
• 4.2.5 酚酸类成分与抗氧化活性之间的相关性
• 4.3 总结
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录
• 附录1
• 附录2
• 附录3
• 附录4
• 附录5
• 致谢
• 攻读学位期间研究成果