多枝赖草（Leymus multicaulis）盐胁迫应答相关基因的克隆及表达分析

论文题目: 多枝赖草（Leymus multicaulis）盐胁迫应答相关基因的克隆及表达分析

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物化学与分子生物学

作者: 史仁玖

导师: 杨清,赵茂林

关键词: 多枝赖草,盐胁迫,差异显示,谷胱甘肽还原酶基因,克隆

文献来源: 南京农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 多枝赖草（Leymus mul ticaulis＜Kar1 & Kir1＞Tzvel 1，2n=4X=28，XmXmNsNs）属于小麦近缘属赖草属，分布于欧亚地区不同的生态环境下，我国主要分布于新疆地区，生长于平原绿洲和盐渍化荒漠草甸，具有突出的耐瘠薄、耐盐碱性、耐寒性等特性。开展多枝赖草抗逆分子生物学研究，分离耐盐相关基因，对于农作物的耐盐育种具有重要意义。本研究以盐胁迫下的多枝赖草叶片为材料，改良了多枝赖草叶片总RNA提取方法，建立了适合多枝赖草的mRNA差异显示体系，分离与分析耐盐相关基因cDNA序列，克隆谷胱甘肽还原酶基因。结果如下： 采用四种方法提取多枝赖草叶片总RNA（异硫氰酸胍法、SDS法、CTAB法和TRIZOL试剂快速提取法），结果表明：TRIZOL提取法提取的RNA产量较低，电泳呈现出28SrRNA、18SrRNA和5SrRNA三条清晰的条带，A260／A280为1.845，A260／A230为2.091，表明RNA的纯度很高。而另外三种方法获得的RNA纯度低，有降解现象。用TRIZOL法提取的RNA作为模板，可以扩增出组成型Actin基因片段，表明提取的多枝赖草叶片总RNA能够满足分子生物学研究需要。 通过对退火温度、模板用量、Taq酶和Mg2+浓度的优化，建立了适合多枝赖草基因差异显示的DDRT-PCR体系。选用26个随机引物，分别与3个锚定引物组合成引物对，进行盐胁迫下多枝赖草mRNA差异显示，获得17个长度在300～600bp的差异cDNA条带，进行序列测定及分析。反Northern杂交分析筛选出11个阳性片段。 GenBank／BLAST分析，DNA片段1编码的蛋白与腺苷酸结合蛋白有29％的相似，这与DNA的表达调节有关；cDNA片段2编码的蛋白质与与UMP／CMP kinase 42％相似，UMP／CMP kinase与核苷酸的磷酸化有关，在信号传导方面起作用cDNA片段4编码的蛋白质与S9蛋白有49％的相似性，S9蛋白具有清除活性氧的功能，而活性氧是各种水分胁迫的主要伤害

论文目录:

中文摘要

英文摘要

文献综述

第一节 中国盐碱地概况

第二节 植物耐盐生理生化研究

第三节 植物耐盐分子机理的研究

第四节 多枝赖草研究进展

参考文献

第一部分 盐胁迫下多枝赖草基因的差异表达

第一章 前言

第二章 多枝赖草总 RNA提取、纯化方法的建立

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

1.1.2 试剂

1.1.3 DEPC处理水及器皿

1.1.5 仪器设备

1.2 方法

1.2.1 多枝赖草叶片 RNA提取方法

1.2.1.1 异硫氰酸胍法

1.2.1.2 CTAB法

1.2.1.3 SDS法

1.2.1.4 TRIZOL试剂快速提取法

1.2.2 总 RNA浓度及纯度检测

1.2.3 总 RNA电泳

1.2.4 RNA样品中微量 DNA的去除

1.2.5 mRNA差异显示

1.2.5.1 cDNA第一链的合成

1.2.6 多枝赖草Actin基因保守区cDNA的特异扩增

2 结果与分析

2.1 不同方法提取总 RNA的产量与纯度比较

2.2 不同方法提取总 RNA的质量比较

2.3 多枝赖草Actin基因保守区cDNA的特异扩增

3 讨论

第三章 盐胁迫下多枝赖草mRNA差别显示体系的建立与优化

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

1.1.2 仪器设备

1.1.3 试剂

1.2 方法

1.2.1 多枝赖草叶片 RNA提取与纯化

1.2.2 cDNA第一链的合成

1.2.3 PCR扩增

1.2.4 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳

2 结果与分析

2.1 RNA的分离提取

2.2 cDNA第一链的合成

2.3 引物的确定

2.4 PCR体系的优化

2.4.1 退火温度的选择

2.4.2 Taq酶的确定

2.4.3 模板量的确定

2.4.4 Mg~(2+)的确定

3 讨论

第四章 多枝赖草耐盐相关cDNA的克隆与鉴定分析

1. 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 多枝赖草叶片总 RNA提取

1.2.2 cDNA第一链的合成

1.2.3 PCR扩增

1.2.4 6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

1.2.4.1 变性聚丙烯酰胺凝胶的制

1.2.4.2 电泳

1.2.4.3 银染

1.2.5 差异条带的回收及二次扩增、检测

1.2.6 第二次 PCR产物回收

1.2.7 CaCl_2法制备感受态大肠杆菌细胞

1.2.S PCR产物的克隆

1.2.8.1 连接

1.2.8.2 转化

1.2.9 阳性克隆的鉴定与保存

1.2.10 质粒提取和酶切

1.2.11 序列测定

1.2.12 Reverse Northern杂交

1.2.13 定量 PCR检测

2 结果与分析

2.1 多枝赖草总 RNA的提取

2.2 盐胁迫下基因差异表达

2.3 特异cDNA片段序列分析

2.4 反 Northern Blotting

2.5 片段3和11基因的表达

3 讨论

参考文献

第二部分 多枝赖草谷胱甘肽还原酶基因的克隆及表达分析

第一章 前言

第二章 多枝赖草谷胱甘肽还原酶cDNA的克隆与分析

1 材料与方法

1.1 植物材料

1.2 方法

1.2.1 总 RNA的制备

1.2.2 引物设计及 RT-PCR扩增

1.2.3 GR基因cDNA片段的PCR扩增

1.2.4 PCR产物的克隆和测序

1.2.5 5'RACE和3'RACE

1.2.6 DNA序列、氨基酸序列的计算机分析

2 结果与分析

2.1 总RNA的提取

2.2 GR基因片段的 RT-PCR扩增和重组质粒的鉴定

2.3 阳性克隆的测序

2.4 GR基因5’和3’端cDNA的克隆

2.5 推断的GR蛋白的功能及进化分析

3 讨论

第三章 盐胁迫下多枝赖草谷胱甘肽还原酶基因的表达

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 总 RNA的制备

1.2.2 多枝赖草基因组 DNA的提取

1.2.2.1 SDS法

1.2.2.2 CTAB法

1.2.3 Southern blotting

1.2.4 Northern blotting

1.2.5 表达产物半定量 PCR检测

2 结果与分析

2.1 多枝赖草基因组 DNA的提取

2.2 GR基因 Southern blotting

2.3 逆境胁迫下 GR基因的表达

2.4 表达产物定量 PCR

3 讨论

参考文献

全文结论

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

发布时间: 2006-10-20

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