复合调控Waxy与SBE3基因提高水稻直链淀粉含量的研究

论文摘要

淀粉主要由直链淀粉和支链淀粉组成，其中直链淀粉含量的高低是决定稻米品质及其用途的重要因素。通过对水稻胚乳中淀粉合成相关基因表达的调控，可改变稻米中直链淀粉的含量，进而选育优质或者特用的水稻新品种。本研究利用根癌农杆菌介导转基因的方法将包含Waxy（Wx）基因过量表达结构和SBE3基因RNA干涉结构的复合表达载体导入粳稻品种日本晴中，有效地调控了Wx基因和SBE3基因的表达，进而提高了稻米胚乳中直链淀粉的含量。主要研究结果如下：1、本研究参考发表在GeneBank中的基因序列，设计特异性PCR扩增引物，利用RT-PCR方法，从粳稻品种日本晴的未成熟种子中克隆到完整的水稻淀粉粒结合型淀粉合成酶（Granule-bound starch synthaseⅠ，GBSSⅠ，即WAXY）蛋白质编码区cDNA；并利用PCR方法从粳稻品种日本晴基因组DNA中克隆到水稻淀粉分支酶3（Starch branching enzyme3,SBE3）蛋白质基因片段。2、经检测获得的Wx基因蛋白质编码区cDNA全长为1830bp，编码610个氨基酸。该序列与已发表的水稻GBSSⅠ蛋白编码区cDNA序列相比，有两个核酸发生突变，推导的氨基酸中也有两个氨基酸发生突变，但这并没有影响到蛋白的正常活性。从水稻基因组DNA中克隆到的水稻RBE3基因片段长为195bp，与已发表的序列完全一致。3、利用获得的完整水稻Wx基因蛋白质编码区cDNA及水稻RBE3基因片段，在pCAMBIA1301载体的基础上构建Wx过量表达与SBE3干涉结合的多基因表达载体，并以GluA3启动子调控这两个基因的转录表达。4、将构建的水稻多基因表达载体导入受体粳稻品种日本晴中，获得了48株PCR检测为阳性的转基因植株。半定量RT-PCR检测发现，T0代植株部分籽粒中Wx基因表达水平明显升高，而SBE3基因表达水平则降低了。5、T1代转基因植株直链淀粉含量测定表明，转基因水稻种子的直链淀粉含量得到了明显的提高，平均提高了45%。转基因水稻株系的农艺性状株高、穗长、分蘖数、结实率和千粒重与对照相比差异不显著。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1.文献综述
• 1.1 淀粉的分类与结构
• 1.2 淀粉的功能特性及应用
• 1.2.1 直链淀粉的用途
• 1.2.2 支链淀粉的用途
• 1.2.3 高直链淀粉的用途
• 1.3 禾谷类植物淀粉的生物合成
• 1.4 淀粉合成关键酶
• 1.4.1 AGPG 焦磷酸化酶（ ADPGlc pyrophosphorylase，AGPP）
• 1.4.2 淀粉合成酶 （starch synthase，SS）
• 1.4.3 淀粉分支酶 （Starch Branching Enzyme，SBE）
• 1.4.4 淀粉脱分支酶 （Starch debranching enzyme，SDBE）
• 1.5 基因工程改良淀粉品质的研究进展
• 1.5.1 反义 RNA 技术及其应用
• 1.5.2 RNA 干扰技术及其应用
• 1.5.3 基因过量表达技术的应用
• 2.引言
• 3.材料与方法
• 3.1 材料和试剂
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 菌株和载体
• 3.1.3 试剂
• 3.1.4 培养基
• 3.1.5 仪器设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 引物设计
• 3.2.2 水稻总 DNA 的提取（CTAB法）
• 3.2.3 Trizol 法提取水稻灌浆期种子总 RNA
• 3.2.4 反转录
• 3.2.5 目的片段的扩增与修饰
• 3.2.6 PCR 产物的回收
• 3.2.7 PCR 产物与 pGM-TEasy Vector 的连接
• 3.2.8 质粒的提取
• 3.2.9 连接产物转化大肠杆菌 Top10 感受态细胞
• 3.2.10 质粒的酶切与目的片段的回收
• 3.2.11 目的基因的鉴定
• 3.3 复合表达载体的构建
• 3.3.1 pCAMBIA1301 载体的改造
• 3.3.2 复合载体的构建
• 3.4 分子调控载体转化农杆菌
• 3.5 水稻的转化及遗传分析
• 3.6 分子调控效应的检测
• 4.结果和分析
• 4.1 淀粉合成关键酶 Wx 与 SBE3 基因的克隆和分析
• 4.1.1 水稻基因组 DNA 和胚乳总 RNA 的提取
• 4.1.2 淀粉合成关键酶基因 Wx 和 RBE3 的克隆
• 4.1.3 关键酶基因的序列分析
• 4.2 淀粉合成关键酶基因的分子调控
• 4.2.1 淀粉合成关键酶基因分子调控载体的构建
• 4.2.2 水稻的转化及遗传分析
• 4.3 分子调控的效应分析
• 4.3.1 T1 调控基因表达的半定量 RT- PCR 检测
• 4.3.2 T1植株胚乳直链淀粉含量及千粒重的检测
• 5.讨论
• 6.结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介
• 攻读硕士学位期间发表的论文