论文摘要
菜薹（Brassica campestris L.ssp.Chinensis var. utilis Tsen et Lee）又称菜心,属于十字花科芸薹属芸薹种白菜亚种的一个变种,原产中国,是华南地区重要的特产蔬菜之一。利用分子标记技术进行菜薹雄性不育和抽薹性基因定位对菜薹品质创新和选育新品种具有重要意义。目前尚未见有利用ISSR分子标记技术进行菜薹雄性不育和抽薹性分析的研究报道。本研究利用正交试验法成功设计并优化了菜薹ISSR技术体系;同时从基因组DNA入手,利用分子标记技术寻找与菜薹雄性不育基因相关的分子标记;克隆菜薹雄性不育基因,为利用菜薹不育性提供基础;采用BSA法对菜薹的抽薹基因进行ISSR和SRAP标记筛选,探索利用分子标记进行抽薹基因选择的可行性,获得了四个与菜薹抽薹基因连锁的ISSR和SRAP分子标记。利用ISSR和SRAP技术对一份菜薹杂交组合的双亲和F1进行了引物筛选,初步建立了应用于鉴定菜薹亲本及其F1的分子指纹图谱,并转化为数字指纹图谱。研究的主要结果如下:1.利用正交试验设计方法,从TaqDNA聚合酶、dNTP、引物、Mg2+ 4种因素3个水平对菜薹ISSR反应体系进行了优化,确立了适合菜薹的ISSR反应体系并在7个菜薹品种中进行了验证。在20μL反应体系中,含TaqDNA聚合酶1U、dNTP 250μmol/L、引物0.25μmol/L、1×PCR buffer、Mg2+ 2.5mmol/L、模板DNA30ng。通过梯度PCR测验,确定了适宜的退火温度。这一体系的建立为今后利用ISSR技术进行菜薹种质资源分类、遗传图谱构建和基因定位奠定了技术基础。2.利用ISSR技术对菜薹雄性不育系及其保持系的基因组DNA进行比较分析;同时基于同源序列的候选基因法,通过检索NCBI核酸数据库,获得细胞质雄性不育相关的基因或开放阅读框序列。运用生物学软件分析方法,根据保守区设计1对CMS特异引物,对不育系和保持系的基因组DNA进行PCR扩增。100个ISSR引物中,只有引物UBC843在两系之间扩增出了差异性条带,找到了不育系和保持系间的特异扩增片段。回收该特异扩增片段并进行克隆测序,测序结果表明该片段全长为462bp,与白菜其它育性相关序列比较,同源性均低于50%。根据测序结果设计了1对特异引物,将其转化为更稳定的SCAR标记。CMS特异引物标记在不育系中扩增出675bp的特异片段。序列分析表明该片段与Pol型胞质不育orf224基因同源性为100%。ISSR引物扩增得到的特异片段很有可能来自核DNA,CMS特异扩增结果表明实验所用的菜薹其不育类型为胞质Pol型。3.本研究以早抽薹品种CT07和晚抽薹品种T0601为亲本构建了F2分离群体。用45条ISSR引物和20对SRAP引物组合进行PCR扩增筛选,其中UBC834、UBC876、E13M4和E5M7对亲本和DNA池间的扩增图谱表明,四个引物的差异条带均出现在父本和早现蕾池中。经F2代群体单株验证,四个标记均与早抽薹基因相连锁,且标记E13M4最近,距离为16.8cM,这为菜薹抽薹基因的定位和分子标记辅助育种奠定了初步基础。4.利用ISSR和SRAP两种分子标记技术,对1份菜薹杂交组合进行分析。结果表明3个ISSR引物和3对SRAP引物可扩增出供试材料双亲的互补特征带,将双亲及杂种F1区分开;另有2个ISSR引物也可有效鉴别双亲及杂种F1。从而建立了由ISSR和SRAP两种标记技术组成的鉴定该杂交组合的分子指纹图谱,并转化为数字指纹图谱,为菜薹种子纯度的鉴定开辟了新的技术途径,为新品种知识产权的保护提供了重要手段。