嗜热脂肪芽孢杆菌CHB1耐热机制初步研究

论文摘要

嗜热菌是地球上生活在高温环境中的一类微生物,在基因工程、酶工程、采矿工程和废弃物处理方面有巨大的应用价值。嗜热菌对高温的适应性更是许多科研工作者努力寻求解释的问题。论文以本实验室筛选的嗜热脂肪芽孢杆菌CHB1为出发菌株,研究了该菌的嗜热程度,发现液体发酵条件下CHB1最低生长温度高于48℃,最高生长温度达74℃.,最适温度为55-65℃,是一株非常耐热的细菌。为了探索CHB1热适应机制,应用蛋白质组学方法比较了对数生长期CHB1在50℃和70℃高温热激条件下蛋白表达的变化,发现了8个差异表达的蛋白,成功鉴定了其中4个蛋白和两个预测蛋白。这4个差异蛋白分别是ClpP蛋白酶、HtrA蛋白酶、乙醇脱氢酶、组氨酸氨基转移酶,两个预测蛋白是甲基转移酶和百草枯诱导的ProteinB。其中ClpP蛋白酶和HtrA蛋白酶均为热休克蛋白,与CHB1耐热机制关系密切。乙醇脱氢酶和组氨酸转移酶为代谢酶类。通过对比60℃培养和低温50℃、高温70℃处理情况CHB1细胞膜脂肪酸的PLFA图谱,发现CHB1细胞膜脂肪酸几乎全为饱和脂肪酸,三个温度条件下几乎不发生不饱和脂肪酸比例的变化,这与CHB1有天然的耐热性相适应。但是,随着温度的升高长链饱和脂肪酸比例明显升高,短链饱和脂肪酸比例有下降趋势,说明CHB1主要依靠增加碳链的长度来适应更高温度的胁迫。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 嗜热菌及其研究进展
• 1.2 嗜热菌的研究价值
• 1.3 嗜热菌的耐热机理
• 1.3.1 细胞膜耐热研究
• 1.3.2 核酸耐热性研究
• 1.3.3 蛋白质耐热机制的研究
• 1.4 嗜热脂肪芽孢杆菌研究进展
• 1.4.1 嗜热脂肪芽孢杆菌的分类地位
• 1.4.2 嗜热脂肪芽孢杆菌的应用
• 1.4.3 嗜热脂肪芽孢杆菌的研究现状
• 1.4.4 嗜热脂肪芽孢杆菌嗜热机制的研究进展
• 1.5 蛋白质组学研究进展
• 1.5.1 蛋白质组学简介
• 1.5.2 蛋白质组学相关技术
• 1.5.2.1 蛋白分离技术
• 1.5.2.2 蛋白质鉴定技术
• 1.5.3 微生物蛋白质组学研究进展
• 1.5.3.1 蛋白质组学在微生物研究领域的应用
• 1.5.4 蛋白质组学与微生物应激反应
• 1.6 磷脂脂肪酸分析技术在微生物应激研究中的应用
• 1.7 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 培养基配方
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 仪器
• 2.1.5 溶液配制
• 2.1.5.1 双向电泳溶液
• 2.1.5.2 磷脂脂肪酸提取试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 不同温度培养CHB1的生长曲线
• 2.2.2 温度胁迫条件下CHB1生长曲线
• 2.2.3 差异蛋白质组研究方法
• 2.2.3.1 CHB1菌体全蛋白的提取
• 2.2.3.2 等电聚焦（17cm,pH3-10和17cm胶条pH4-7）
• 2.2.3.3 胶条平衡及第二向SDS-PAGE电泳
• 2.2.3.4 胶体考马斯亮蓝染色
• 2.2.3.5 凝胶扫描
• 2.2.3.6 蛋白点的酶解
• 2.2.3.7 蛋白质质谱鉴定和数据检索
• 2.2.4 温度胁迫下CHB1细胞膜磷脂脂肪酸变化
• 2.2.4.1 CHB1细胞膜脂肪酸提取
• 2.2.4.2 PLFAs的检测条件
• 3 结果与分析
• 3.1 CHB1生物学特性
• 3.1.1 CHB1菌株鉴定结果
• 3.1.2 CHB1菌体形态
• 3.1.3 CHB1投射电镜观察
• 3.1.4 CHB1菌落形态
• 3.2 不同温度培养CHB1生长曲线
• 3.3 温度胁迫条件下CHB1生长曲线
• 3.4 温度差异蛋白质组学结果分析
• 3.4.1 胶条pH值梯度的选择
• 3.4.2 CHB1温度差异蛋白的确定
• 3.4.3 CHB1温度差异蛋白的鉴定
• 3.5 温度胁迫下CHB1细胞膜磷脂脂肪酸（PLEA）变化
• 4. 讨论
• 4.1 关于CHB1液体培养条件下温度适应性问题
• 4.2 重要的CHB1温度差异蛋白
• 4.2.1 ClpP蛋白酶
• 4.2.2 HtrA蛋白酶的功能
• 4.2.3 乙醇脱氢酶的功能
• 4.2.4 其他蛋白质的分析
• 4.3 CHB1细胞膜脂肪酸对温度胁迫的响应
• 结论与展望
• 参考文献
• 致谢