皮质发育障碍模型鼠大脑的病理特征和体视学研究

论文摘要

目的:主要探寻DCD大鼠大脑半球、海马的体积变化、海马苔藓纤维发芽和皮质下异位结节中神经元的形态、数量,突触数量,白质有髓神经纤维数量等常规病理学和精确病理学构成特点,结合模型鼠的行为学、脑电图、致癫痫敏感性,探讨DCDs所致IE的发生机制。方法: 1.建立X-射线照射诱导的皮质下异位结节大鼠DCD模型,详细观察其行为、脑电变化及致痫敏感性;2.使用组织病理学技术（包括大体标本观察、光镜下常规和特殊染色观察、透射电境超微结构检查等）和体视学技术观察DCD大鼠皮质下异位结节中神经元的形态、数量,突触的数量,纤维种类、体积、长度,海马苔藓纤维发芽等;3.采用SP免疫组织化学方法检测神经元特异核蛋白抗原NeuN、星形胶质细胞特异抗原GFAP,以及突触标志物抗体蛋白Spy、突触生长相关蛋白GAP-43,在大鼠脑皮质下异位结节和海马中的表达,光镜观察并在Gundersen测试系统下计数,或GD-8型病理影像多媒体图文操作系统分析。4.用SPSS10.0统计软件,结果各组数据取均数±标准差（?x±s）表示符合正态分布者的平均数,P<0.05表示有意义,组间比较t检验。不符合正态分布者的水平,一组或一组以上资料则运用秩和检验（ranksun test）进行总体和（或）组间比较分析。结果: 1. DCD鼠行为学、脑电图及致癫痫敏感性的观察（1）DCD大鼠无肢体偏瘫,对刺激反应较强,约10%有自发性面、耳部抽搐发作和点头样动作,但Racine标准仅达1、2级,无四肢抽搐,90%表现活动增多、兴奋躁动、易激惹、搔抓和“洗脸样活动”频繁。约30%的DCD大鼠表现行动迟缓,觅食、觅水困难,空间记忆严重降低,精神发育迟滞。正常对照组和母鼠组大鼠无抽搐发作,精神行为未见异常。（2）60%的DCD大鼠自然状态下EEG显示额叶皮质及海马有频繁自发的棘波、尖波、棘慢波发放。而正常对照组和母鼠组大鼠皮层EEG无异常。（3）90%DCD大鼠被KA诱发痫性发作的级别评分、痫性发作持续总时间、每次痫性发作持续时间、脑电图异常改变均明显多于正常对照组或母鼠组大鼠。2. DCD鼠大脑组织常规病理观察（1）大体标本观察:DCD组鼠的大脑、小脑表面无异常发现,但大脑体积变小,四叠体明显暴露。冠状切面可见胼胝体缺失,各脑室系统扩大,皮质下巨大灰质团块,海马结构异常,脑皮质明显变薄,约为正常的60%。（2）组织和细胞学观察:①H.E.染色大脑皮质和皮质下白质有多个异位结节,大小不均,其内结构紊乱,细胞形态不清,神经元固缩或坏死,胶质细胞增生,有巨大神经元、形态异常神经元和不成熟神经元,分子层可见气球样细胞。海马CA1区有巨大的环状结节,其中有锥体细胞缺失、形态异常神经元,CA3区细胞排列紊乱,侧脑室扩大最明显。②Nissl染色可见皮层结构紊乱,结节多位于Ⅰ～Ⅲ层,海马CA1区团块状结节清楚可见,CA2有中断,CA3结构紊乱。Nissl染色连续切片结果显示随年龄增加皮质第Ⅰ～Ⅲ层、室周或皮质下白质和海马CA1区也可观察到皮质异位结节,P2以后异位皮质结节迁徙达相对稳定的部位。P0以后皮质下异位结节像“桥”一样将大脑皮质与海马连接起来。③Timm’s染色可见双侧海马CA3区苔藓纤维发芽;④LFB染色皮质Ⅰ层髓鞘增生,而皮质下白质部分髓鞘脱失。3.超微结构观察:DCD鼠脑皮质Ⅱ～Ⅲ层、皮质下异位结节、白质、CA1和CA3锥体细胞层可见神经元凋亡,神经元胞核空泡化、胞浆解体,锥体神经元内线粒体肿胀,内质网扩张,胶质细胞轻度肿胀,毛细血管周围水份积聚及内膜损坏,有髓和无髓神经纤维两种,有髓神经纤维脱髓鞘改变,组织中散布许多“髓样”结构,突触前膜水肿。4.DCD鼠大脑体视学观察（1）从出生到成年后DCD大鼠体重平均减少19%（P>0.05）。出生时DCD鼠脑质重较正常,从7d～31w时仅平均为正常对照组的57%（P<0.05）。出生时DCD鼠脑体积正常,P7以后各时期DCD鼠脑体积平均减少36%（P<0.05）。虽然DCD鼠脑皮质体积也平均减少19%,并随着年龄的增加体积减少越明显,但无显著差异（P>0.05）。DCD鼠从P7以后海马体积平均减少39%（P<0.05）,且CA1区体积也随龄增加而平均减少32%,但仅P56和P84与同龄对照组比较明显减少38%和36%（P<0.05）。皮质/大脑半球、海马/大脑半球和CA1/海马的体积分数各年龄组平均减少20%、21%和27%,但仅P56和P84的CA1/海马明显减少37%和35%（P<0.05）。各龄DCD组皮质Ⅰ层、海马CA2区、CA3区、门区及齿状回区体积与对照组比较无统计学意义。DCD组皮质下白质中的异位结节与正常对照组或母鼠组皮质下白质中神经元数密度、细胞数密度、神经元百分比比较增加99倍、121倍和64倍,有显著统计学意义,P<0.05,神经元细胞核Feret直径的平均水平比较无统计学意义。DCD鼠大脑、海马体积减小主要是冠状位的缩短。DCD大鼠皮质第Ⅰ层异位结节、皮质下异位结节和海马异位结节结构及细胞特征比较与皮质Ⅱ～Ⅲ层皮质结节相似。（2）DCD组鼠脑白质有髓神经纤维长度密度较正常对照组降低64%,有髓神经纤维总长度较正常对照组降低80%,均存在显著差异,P<0.05。有髓神经纤维体积密度较正常对照组减低11%,无统计学意义,P>0.05,而总体积降低52%,有显著差异,P<0.05。DCD鼠海马CA1异位结节、CA3突触数密度较正常对照组降低26%、28%,但无统计学意义,P>0.05。5. DCD鼠大脑免疫组化观察:与正常对照或母鼠组白质比较,皮质下异位结节内NeuN免疫阳性神经元和GFAP免疫阳性细胞数密度分别增加30倍和16倍,有统计学意义,P<0.05,而GAP-43免疫阳性产物数密度和Spy免疫阳性产物平均光密度均增加10倍,有统计学意义,P<0.05。同龄DCD鼠脑皮质Ⅰ～Ⅲ层异位结节、皮质下异位结节和CA1异位结节中NeuN、GFAP、GAP-43数密度或Spy阳性平均光密度值比较无变化,无统计学意义。海马CA3区多形层和DG区内分子层可见Spy免疫阳性产物表达增强,而GAP-43数密度仅在CA3区多形层增加,提示苔藓纤维发芽反应。结论:1.经改进后的X-射线照射孕17天大白鼠制作DCD模型操作简单、成功率高、死亡率低,能模拟人类灰质异位症、结节性硬化、海马结节异位及胼胝体缺失等DCDs畸形,对研究与脑DCD有关的癫痫发病机制提供了很好的动物模型。2.经X-射线诱导的DCDs阻断了正常皮质发育进程,最终导致皮质结构紊乱和海马异常,形成了典型DCD的组织病理特征。DCD鼠脑皮质异位结节的发生过程提示皮质下异位结节桥接大脑皮质与海马,使之形成一道异常的神经网络。DCD鼠海马CA3区和DG区的苔藓纤维发芽提示局部异常兴奋性神经网络的形成。皮质异位结节的形成和皮质及海马异常神经网络的建立提示DCD导致癫痫发生的组织病理学基础。3.运用生物体视学方法观察到随年龄的增加DCD鼠大脑、海马体积均减小。皮质下异位结节的侵蚀、有髓神经纤维总长度减少和髓鞘脱失可能导致白质体积的减少的直接原因。异位结节掺合于白质中导致有髓神经纤维髓鞘脱失,而皮质下异位结节中神经元胞浆线粒体病损明显,突触却不明显,提示线粒体启动的电活动可能经轴索、突触形成更多的神经网络传播。DCD鼠皮质第Ⅰ层异位结节、皮质下异位结节和海马异位结节的组织特性比较与皮质Ⅱ～Ⅲ层相似。生物体视学方法能检测大鼠大脑的精确病理学构成,是一种很好的研究方法。4. DCD鼠脑神经元核心蛋白及星形胶质细胞和突触受体及生长相关蛋白的分布证实了皮质下异位结节的内在属性,异位结节是灰质,主要是神经元和星形胶质细胞构成。突触受体及生长相关蛋白的变化也可佐证海马苔癣纤维的发芽,提示海马兴奋性神经网络的形成及导致癫痫发生的蛋白质表达异常,兴奋和抑制失平衡最终引起癫痫发作。选用Spy抗体经SP法检测海马苔藓纤维发芽较Timm’s组化法更敏感。

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• 英文摘要
• 论文正文：皮质发育障碍模型鼠大脑的病理特征和体视学研究
• 前言
• 第一部分 皮质发育障碍模型鼠行为、脑电及致癫痫敏感性研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二部分 皮质发育障碍模型鼠大脑的病理学研究
• 第一节 皮质发育障碍模型鼠大脑组织病理观察
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二节 皮质发育障碍模型鼠大脑皮质病灶组织的超微结构观察
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第三部分 皮质发育障碍模型鼠大脑皮层、白质和海马体视学研究
• 第一节 皮质发育障碍模型鼠脑皮质、海马光镜体视学研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二节 皮质发育障碍模型鼠脑白质有髓神经纤维体视学研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第四部分 皮质发育障碍模型鼠大脑 NeuN、GFAP、SPY、GAP-43 表达研究
• 第一节 NeuN 和GFAP 在皮质发育障碍大鼠脑中的表达
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二节 Spy 和GAP-43 在皮质发育障碍大鼠脑中的表达
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 表格
• 附图
• 小结
• 文献综述一
• 文献综述二
• 致谢
• 攻读博士期间撰写及发表的论文和参加会议的情况