论文摘要
研究背景与目的神经病理性疼痛（neuropathic pain）是外周或中枢神经系统的结构受到损伤或功能发生紊乱而引起的疼痛。可表现为自发性疼痛（spontaneous pain）、痛觉过敏（hyperalgesia）和触诱发痛（allodynia）等多种临床症状。这些疾病的共同特点是临床常规的镇痛治疗效果不佳。由此引发了人们对神经病理性疼痛产生机制及药物镇痛机制的广泛研究。脊髓神经元敏感化（spinal cord central sensitization）是病理性疼痛的产生、发展和维持的重要的细胞学基础之一。越来越多的证据表明多肽在神经病理性疼痛的调控中发挥重要作用。近来,一种较新的内源性阿片肽类受体-递质系统—孤啡肽和其受体在痛信号的传递和调制过程中的作用已引起了人们的高度重视。在脊髓中,孤啡肽富集于脊髓背角。脊髓背角尤其胶质区是伤害性信息传入和调制的第一站,在此部位抑制痛觉信息是最经济而有效的。因此,在脊髓水平研究孤啡肽与痛觉的感受和调控有着重要的理论和实践意义。敏感化的产生有赖于神经元细胞膜上受体增多或离子通道功能的增强,而上述改变又依赖于细胞内信号转导系统特别是激酶系统的激活,激活后的激酶可通过磷酸化神经元膜受体或离子通道,改变神经元的兴奋性。蛋白激酶C（proteinkinase C,PKC）是神经系统中最重要的蛋白激酶之一。已有大量的证据表明PKC的活化参与伤害性刺激引起的脊髓神经元敏感化的形成、发展和维持。NMDA受体NR1亚单位是NMDA受体复合物的主要功能亚单位,丝氨酸896位点（serine896）是NR1亚单位发生磷酸化的主要位点之一。激活的PKC可磷酸化NR1亚单位serine 896位点,从而增强NMDA受体功能。NR1亚单位异常激活是脊髓敏感化乃至痛觉过敏产生的重要机制。由于NMDA受体及PKC的活化都受孤啡肽信号传导的调控。因此推测,脊髓PKC依赖性NMDA受体NR1亚单位磷酸化可能参与孤啡肽脊髓水平的痛觉调节作用。本研究的目的在于探讨脊髓NMDA受体上PKC磷酸化位点NR1亚单位serine 896的磷酸化水平与孤啡肽痛觉调节作用的关系。论文一鞘内注射孤啡肽对大鼠脊髓NMDA受体NR1亚单位磷酸化的影响实验材料和方法1、雄性SD大鼠16只,随机分为生理盐水（normal saline,NS）对照组和孤啡肽（orphanin FQ,OFQ）组（n=8）。以动物疼痛相关反应的时间为指标,在OFQ鞘内注射后20分钟内每间隔5分钟对动物自发性疼痛表现作综合评分。2、以甩尾潜伏期作为痛阈指标,用热水甩尾法观察OFQ鞘内注射后20分钟甩尾潜伏期的变化。3、观察鞘内预先注射NMDA受体拮抗剂MK-801,PKC抑制剂chelerythrine或OFQ拮抗剂痛稳素（nocistatin,NST）对OFQ诱发的自发性疼痛表现及热痛敏形成的影响。4、利用western blot方法观察OFQ鞘内注射后5,30,60,120分钟后大鼠脊髓NMDA受体PKC磷酸化位点NR1 serine-896的磷酸化水平及磷酸化PKCα（pPKCα）表达的变化。实验结果1、鞘内注射OFQ 50 pg后10～15分钟诱发了特征性自发性疼痛反应,表现为:过度舔爪、搔抓、嘶叫以及间隙性后肢的跛行。与NS组比较,OFQ组大鼠自发性疼痛表现的总时间明显增多（40.9±3.4 vs.5.2±0.9）,差异有显著性（P＜0.01）。疼痛反应在OFQ注射后20分钟消失。2、和基础值比,鞘内注射NS对大鼠的甩尾潜伏期无明显影响。而鞘内注射OFQ后10～15分钟,甩尾潜伏期较基础值和NS组缩短（P＜0.05）,注射后15分钟OFQ的作用达顶峰。3、鞘内单独注射MK-801（0.5μg）,chelerythrine（20μg）和NST（10μg）对动物行为活动及甩尾潜伏期无明显影响,但明显减少OFQ鞘内注射引发的疼痛相关行为反应的时间并取消OFQ缩短大鼠甩尾潜伏期的效应。4、OFQ注射后30分钟磷酸化NMDA受体NR1亚单位serine-896（pNR1serine-896）与磷酸化PKCα（pPKCα）水平开始上升,60分钟达高峰,维持120分钟。与NS对照组比较,OFQ注射后30～120分钟间pNR1 serine-896及pPKCα表达明显增加,差异有显著性（P＜0.05）。论文二鞘内注射痛稳素对NMDA诱发的疼痛及大鼠脊髓一氧化氮合酶的影响实验材料和方法1、参照文献报道,鞘内注射NMDA建立疼痛模型。SD大鼠,随机分为二组（n=8）:NS+NMDA组和痛稳素（nocistatin,NST）+NMDA组。在NST（10μg）鞘内注射后20分钟,鞘内注射NMDA 1μg,在NMDA注射后20分钟内对动物自发性疼痛表现作综合评分;并用热水甩尾法观察NMDA鞘内注射后60分钟内动物甩尾潜伏期的变化。旨在观察鞘内预先注射OFQ受体拮抗剂NST对NMDA诱发的自发性疼痛和热痛觉异常的影响。2、NMDA受体被激活后,引发一系列下游反应,包括激活一氧化氮合酶（NOS）。本文运用依赖还原型辅酶Ⅱ的黄递酶（NADPH-d）组织化学法,通过观察鞘内注射NST对大鼠NMDA鞘内注射诱发痛过敏过程中脊髓背角NADPH-d阳性神经元数量（NADPH-d反映NOS的活性）的影响,进一步佐证脊髓水平孤啡肽诱发的自发性疼痛及热痛敏现象与NMDA受体的关系。实验结果1、鞘内注射NMDA（1μg）诱发了自发性疼痛反应,表现为:过度舔爪、嘶叫以及间隙性后肢的跛行以及抓挠。NMDA注射10～60分钟内大鼠的甩尾潜伏期较基础值和NS组缩短,差异显著（P＜0.05）。提示,鞘内注射NMDA后动物出现热痛敏。2、与NS+NMDA组比,NST+NMDA组大鼠的自发性疼痛反应的总时间减少。与之相对应,NST+NMDA组大鼠和甩尾潜伏期较NS+NMDA组延长,差异显著（P＜0.05）。提示,NST对NMDA鞘内注射引起的自发性疼痛及热痛觉过敏有显著的抑制作用。3、鞘内注射NMDA后1小时大鼠脊髓NADPH-d阳性神经元、纤维和终末表达明显增加。与NS+NMDA组比,NST+NMDA组大鼠脊髓NADPH-d阳性神经元明显减少,差异显著（P＜0.05）。提示,NST可抑制NMDA受体被激活后其下游产物NOS的活化。论文三鞘内注射痛稳素对甲醛致痛大鼠脊髓NMDA受体NR1亚单位磷酸化的影响实验材料和方法1、大鼠于右后足掌部皮下注射4%甲醛100μl建立甲醛炎性痛疼痛模型。NST和NS组分别在甲醛前30分钟鞘内注射。以1h内动物舔咬后爪的时间为指标来评价疼痛反应。2、在甲醛注射后1小时将所有动物处死取脊髓腰膨大处,采用western blot观察脊髓磷酸化PKCα及磷酸化NMDA受体NR1亚单位serine-896表达的变化。3、采用Fos免疫组织化学、依赖还原型辅酶Ⅱ的黄递酶（NADPH-d）组织化学及Fos/NADPH-d双标技术,观察甲醛诱发疼痛后大鼠脊髓NADPH-d阳性神经元、Fos样免疫反应蛋白（Fos-LI）和Fos-LI/NADPH-d双标阳性神经元数量的变化。实验结果1、大鼠右后肢足底皮下注射甲醛后立即出现缩腿舔爪反应,并呈明显的两个阶段,第一阶段为注射后立即开始,持续约5min,经过10min的间歇期,开始第二阶段,持续约40min。非注射足活动自如,无缩腿舔爪反应。NST组疼痛反应持续时间较NS组短,差异显著（P＜0.05）。与这种行为学的变化相对应,NST可抑制甲醛增加大鼠脊髓pPKCα及pNR1 serine 896的表达的作用,与NS组比较,差异显著（P＜0.05,P＜0.01）。2、甲醛刺激后,大鼠脊髓Fos LI、NADPH d阳性神经元、纤维和终末表达明显增加,且出现Fos LI/NADPH d双标神经元表达。甲醛刺激前给予NST,脊髓背角各层Fos LI神经元和Fos LI/NADPH d双标神经元的数量与NS对照组比均减少（P＜0.05或P＜0.01）。小结本研究发现:①大鼠鞘内注射OFQ可诱发自发性疼痛反应和热痛觉过敏;OFQ的这种作用可分别被鞘内预先注射NMDA受体拮抗剂MK-801,PKC抑制剂chelerythrine,OFQ受体拮抗剂NST明显抑制。与行为学研究相一致,鞘内注射OFQ明显增加大鼠脊髓PKCα和NR1 serine-896磷酸化水平;②大鼠鞘内注射OFQ受体拮抗剂NST抑制NMDA诱发的疼痛以及NMDA受体下游产物NOS的活化;③在甲醛致痛模型上,鞘内注射NST抑制甲醛致痛大鼠的疼痛反应及甲醛所致脊髓PKCα和NR1-serine 896的磷酸化。在此基础上,我们得出以下结论。结论1、脊髓水平微量注射孤啡肽（50 pg）可诱发自发性疼痛反应及热痛敏现象。2、PKCα以及NMDA受体PKC磷酸化位点NR1亚单位serine-896的磷酸化参与孤啡肽在脊髓水平的痛觉调节作用。3、痛稳素有效对抗甲醛诱发的痛觉过敏,该作用可能与痛稳素抑制甲醛致痛大鼠脊髓PKCα、NMDA受体NR1亚单位serine-896的磷酸化以及NOS的活性有关。