缺氧诱导因子1在严重烧伤早期血管通透性调控中的作用

论文摘要

血管内皮的损伤是严重烧伤早期重要的病理变化之一,在烧伤早期损害中起重要作用。血管通透性改变是严重烧伤早期血管内皮损害的主要表现之一,也是严重烧伤早期组织水肿、体液外渗的重要病理基础。血管通透性的变化及其调控机制的研究,对烧伤休克期的处理以及预防烧伤早期损害均有重要意义。但是,严重烧伤后血管内皮细胞通透性变化的机制及调控途径目前尚不清楚。研究表明,血管通透性变化与调节涉及细胞骨架重组、粘附连接、紧密连接结构与功能改变等不同的机制。内皮细胞收缩性改变是不同原因引起通透性增加的共同通路,主要受骨架蛋白中肌球蛋白和肌动蛋白的影响,依赖于肌球蛋白轻链（myosinlight chain,MLC）的磷酸化。肌球蛋白轻链激酶（myosin light chain kinase,MLCK）和肌球蛋白轻链磷酸酶（myosin light chain phosphatase,MLCP）在MLC磷酸化的调控中起着极重要的作用。MLCK的激活可引起MLC的磷酸化;ROCK信号通路活化后,MLCP的磷酸化水平增加,降低MLC的去磷酸化水平,细胞中磷酸化MLC的水平升高。磷酸化的MLC活化肌球蛋白头部的ATP酶,产生的能量使细胞骨架肌动蛋白微丝（F-actin）滑动,细胞发生收缩。热力或某些化学物可直接损伤烧伤局部的血管内皮细胞,但远隔烧伤部位的血管内皮细胞的损害则为间接因素所致。烧伤血清是烧伤导致机体病理生理改变的综合性体液因素,含有大量氧自由基、炎症介质和多种细胞因子。缺血缺氧是严重烧伤早期重要的病理生理变化,也是严重烧伤后多种因素造成组织细胞损害的共同途径,缺血缺氧性损害是严重烧伤早期血管通透性增加的重要机制。大量的转录因子参与缺氧条件下细胞及机体的各种反应,而缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1,HIF-1）被认为是介导机体缺氧反应的重要转录因子。目前认为,不仅HIF-1α蛋白的降解是一个氧浓度依赖的过程,通过缺氧诱导因子1抑制因子（factor inhibiting HIF-1,FIH）的作用,HIF-1α的反式激活功能也受分子氧的调节。常氧条件下,FIH通过不同的机制抑制HIF-1α的转录活性,FIH与HIF-1脯氨酰羟化酶1-3（HIF-1 prolyl hydroxylase 1-3,HPH1-3）共同构成了机体对氧浓度变化的感受器,参与缺氧条件下机体反应的调控。但是,HIF-1α以及FIH在缺氧条件下血管通透性变化中的作用目前尚不清楚。为了探讨严重烧伤后血管内皮细胞通透性变化及调控的机制,尤其是探究HIF-1α及FIH在缺氧条件下血管通透性变化中的作用,本研究在观察严重烧伤早期大鼠血管通透性变化的基础上,以体外培养的单层血管内皮细胞为实验模型,探究MLC磷酸化的升高及其介导的通透性变化在烧伤血清刺激和缺氧（1%O2）诱导后血管通透性变化中的作用和相关机制;通过建立HIF-1α高表达（Forced expression）和HIF-1α低表达（Knock down）、FIH高表达血管内皮细胞系,探讨HIF-1α、FIH在缺氧条件下MLC磷酸化水平变化及血管通透性变化调控中的作用和机制。一、材料与方法1.采用大鼠30%TBSAⅢ度烧伤模型,检测正常及伤后2h、4h、6h、12h、24h不同时相点心、肝、肺、肾、空肠、回肠组织血管通透性及组织含水量;以体外培养的单层血管内皮细胞为模型,观察烧伤大鼠血清刺激后细胞单层细胞完整性与通透性变化,检测p-MLC蛋白的表达与变化、细胞骨架的重排,应用ML-9、Y-27632等阻断剂观察MLCK以及ROCK通路在烧伤血清刺激后血管通透性变化中的作用。检测烧伤血清刺激后MLCK、ROCK-Ⅱ以及ZO-1等细胞连接相关蛋白的表达与变化。2.以体外培养的单层血管内皮细胞为模型,观察缺氧（1%O2）条件下单层细胞完整性与通透性的变化,检测p-MLC蛋白的表达与变化、细胞骨架重排,应用阻断剂ML-9观察MLCK通路在缺氧条件下血管通透性变化中的作用。检测缺氧诱导后MLCK及ZO-1等细胞连接相关蛋白的表达与变化,分别应用放线菌素D和放线菌酮,观察转录与翻译过程在缺氧诱导的MLCK表达中的作用。3.观察缺氧（1%O2）条件下,人血管内皮细胞中HIF-1α蛋白水平的表达变化、核转位以及DNA结合能力、转录诱导能力的变化;应用缺氧模拟剂DMOG刺激细胞,观察常氧条件下MLCK以及p-MLC蛋白水平的表达以及变化;通过转染含有人HIF-1α全长cDNA序列的质粒（pcDNA3.1-V5-HisA-HIF-1α）构建的HIF-1α高表达细胞系和通过转染针对HIF-1α的siRNA质粒（pSUPER-si-HIF-1α）构建的HIF-1α低表达细胞系,研究HIF-1α在缺氧条件下MLC磷酸化所介导的血管内皮通透性改变中的作用。4.观察缺氧（1%O2）以及DMOG诱导下,人血管内皮细胞中FIH蛋白水平的表达变化,通过转染含有人FIH全长cDNA序列的质粒（pcDNA3-FIH）构建FIH高表达（Forcedexpression）的人血管内皮细胞系,研究FIH在缺氧条件下MLC磷酸化所介导的血管内皮通透性改变中的作用。二、主要结果1.严重烧伤后2h,大鼠心、肺、肾脏的血管通透性明显增加,烧伤后4h观察到肝脏血管通透性的增加。随后,随着时间的延续,各脏器的通透性有一个降低的过程,在伤后12h,各脏器的通透性再次升高,并在我们的观察期间（24h）,维持在一个相对较高的水平。严重烧伤后2h,大鼠肾脏含水量即有明显增加,心脏含水量伤后4h开始增加,12h、24h明显高于正常水平;12h、24h肝脏组织含水量明显高于正常。伤后12h空肠组织含水量明显高于正常。2.烧伤血清刺激后,单层细胞的TER明显降低,通透系数增加,细胞中p-MLC水平升高,细胞骨架明显重排,应力纤维形成。ML-9、Y-27632预处理后TER降低幅度明显减小,细胞骨架重排减轻,应力纤维明显减少。ML-9预处理可明显降低烧伤血清诱导p-MLC的升高。烧伤血清明显诱导了MLCK、ZO-1蛋白的表达,而ROCK-Ⅱ、Occludin、Claudin 1等蛋白表达无明显变化。3.缺氧诱导后,单层细胞完整性被破坏,TER明显降低,通透系数明显增加,细胞p-MLC水平升高,细胞骨架明显重排,应力纤维形成。ML-9预处理后TER降低明显减弱,细胞骨架重排减轻,应力纤维明显减少。ML-9预处理可明显抑制缺氧诱导后p-MLC的升高。缺氧明显诱导了MLCK、ZO-1蛋白的表达,而Occludin、Claudin 1等蛋白表达无明显变化。放线菌素D和放线菌酮预处理降低缺氧诱导的MLCK、p-MLC蛋白水平的升高。4.缺氧条件下HIF-1α、HIF-2α蛋白水平明显升高。缺氧6h,HIF-1α核转位、与DNA结合的能力、转录活性均明显增强。常氧条件下DMOG刺激不仅HIF-1α、HIF-2α蛋白水平明显增加,MLCK、p-MLC、ZO-1蛋白水平也明显升高。缺氧条件下建立的HIF-1α高表达细胞系HIF-1α蛋白、mRNA水平明显增加,而HIF-1α低表达细胞系HIF-1α蛋白、mRNA水平明显降低,核转位明显减弱。缺氧24h,HIF-1α高表达细胞系TER降低幅度加大,p-MLC、MLCK、ZO-1蛋白水平增加更明显,而HIF-1α低表达细胞系TER的降低幅度减小,p-MLC、MLCK、ZO-1蛋白增加幅度明显降低,细胞骨架重排减轻。5.缺氧和常氧条件下,DMOG处理均可降低VE细胞中FIH蛋白水平,建立的FIH高表达细胞系中FIH蛋白水平均明显升高,明显抑制HIF-1α转录活性。缺氧24h,FIH高表达细胞系TER降低幅度明显降低,p-MLC、ZO-1蛋白水平亦明显降低,细胞骨架重排明显减轻。三、结论1.严重烧伤早期心、肺、肾、肝等主要脏器的血管通透性、组织含水量明显增加。烧伤血清明显损害体外培养的单层血管内皮细胞的完整性,p-MLC蛋白水平升高介导烧伤血清刺激后通透性的增加。MLCK、ROCK通路均参与了烧伤血清刺激后p-MLC表达的调控。烧伤血清刺激后MLCK蛋白水平的增加,是p-MLC升高的重要调控机制。2.缺氧明显损害体外培养的单层血管内皮细胞通透性,p-MLC蛋白水平升高介导缺氧后通透性的增加。MLCK通路是缺氧后p-MLC表达调控的重要途径。缺氧诱导后MLCK蛋白水平的增加,是p-MLC升高的重要机制,该过程是一个转录依赖的过程。同时,缺氧后ZO-1蛋白明显增加,可能参与缺氧条件下通透性变化的调控。3.缺氧条件下,HIF-1α蛋白水平及活性的增加在血管通透性的变化以及调控中发挥重要作用。HIF-1α参与调控缺氧条件下MLCK蛋白水平的升高及单层细胞中p-MLC水平增加、细胞骨架的重排和应力纤维的形成。另外,HIF-1α也可能通过调控ZO-1蛋白的表达参与缺氧条件下通透性的调控。4.缺氧条件下,FIH在血管通透性的变化及调控中发挥重要作用。FIH参与调控缺氧条件下p-MLC水平的增加、细胞骨架的重排和应力纤维的形成。另外,FIH也可能通过调控ZO-1蛋白表达变化参与缺氧条件下通透性的调控。

论文目录

• 英文缩写略词表
• 英文摘要
• 中文摘要
• 论文正文 缺氧诱导因子1在严重烧伤早期血管通透性调控中的作用
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 烧伤血清诱导血管内皮细胞通透性的变化及机制
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 缺氧诱导血管内皮细胞通透性的变化及机制
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 缺氧诱导因子1在缺氧条件下血管通透性变化中的作用和意义
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第四部分 缺氧诱导因子1抑制因子在缺氧条件下血管通透性变化中的作用和意义
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文结论
• 致谢
• 文献综述 缺氧诱导因子1与炎症反应
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的文章