激活蛋白诱导的水稻叶片SSH文库的构建

论文摘要

植物激活蛋白是一类从多种植物病原真菌中分离得到的新型蛋白质，激活蛋白的核酸和氨基酸序列完全不同于已知的Harpin蛋白和Elicitin蛋白，与数据库中的已知蛋白均无同源性。它通过激活植物体内一系列相关基因，使植株表现出良好的抗病防虫、增强抗逆能力、促进植物生长等生物活性，且性能稳定、易分解、无残留；作为一种新型蛋白质农药，激活蛋白具有广阔的应用前景。为了进一步了解激活蛋白的作用机制，本研究构建了激活蛋白诱导的水稻叶片差异表达基因文库，并对部分基因进行了分析。 抑制性差减杂交(Suppression Subtractive Hybridization，SSH)是一种分离差异表达基因的技术。该技术以差减杂交和抑制性PCR为基础，可快速有效地分离出差异表达基因，假阳性率低，效率较高，广泛用于生物及医学领域差异基因的克隆。 本研究采用从稻瘟菌(Magnaporthe griesea)中分离纯化出的激活蛋白，利用SSH技术，以激活蛋白处理的水稻作为处理组(tester)，空白对照作为对照组(driver)，构建水稻幼苗的正向差异表达cDNA文库。共获得1756个克隆，将其中267个阳性克隆送出测序，最终得到204条序列。 利用BLAST在GenBank数据库中对获得的cDNA序列进行相似性比对分析，除去重复序列后，共得到28个上升表达差异基因。这些基因所编码的蛋白质中有18个为功能已知或推测蛋白，这些基因涉及植物体内各种代谢反应，其中有4个基因参与了叶绿体的形成；3个参与了营养物质的转运代谢；其他的参与诸如细胞的周期调控、胞内细胞器运动、信号传导、基因调控、防卫反应等多种植物的生理生化功能。有10个基因在数据库中找到同源性序列，但功能尚不清楚；本研究为揭示激活蛋白的作用机理奠定基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1 新型微生物蛋白农药
• 1.1 过敏蛋白Harpin
• 1.2 诱导素elicitin
• 1.3 植物激活蛋白Activator
• 2 分离差异表达基因的方法
• 2.1 mDNA差异显示（DD）技术
• 2.2 代表性差异分析法（RDA）
• 2.3 抑制差减杂交技术（SSH）
• 2.4 表达序列标签（EST）技术
• 2.5 基因表达序列分析（SAGE）
• 2.6 cDNA微阵列技术（cDNA microarray）
• 3 研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 1 材料准备
• 1.1 主要试剂和仪器
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 主要仪器
• 1.2 激活蛋白的获得
• 1.2.1 稻瘟菌体的获得
• 1.2.2 蛋白粗提液的制备
• 1.3 水稻样品的获得
• 2 试验方法
• 2.1 总RNA提取与mRNA的分离纯化
• 2.1.1 总RNA的提取
• 2.1.2 mRNA的纯化
• 2.2 SSH文库构建
• 2.2.1 一链cDNA合成
• 2.2.2 二链cDNA的合成
• 2.2.3 Rsa Ⅰ酶解
• 2.2.4 接头连接
• 2.2.5 第一轮杂交
• 2.2.6 第二轮杂交
• 2.2.7 PCR扩增
• 2.2.8 PCR产物的连接与克隆
• 2.3 地高辛杂交检测
• 2.3.1 尼龙膜的制备
• 2.3.2 探针的标记
• 2.3.3 探针标记效率的检测
• 2.3.4 分子杂交
• 2.3.5 免疫学检测
• 2.4 阳性克隆测序及结果分析
• 第三章 结果与分析
• 1 材料准备
• 1.1 激活蛋白的粗提与纯化
• 1.2 水稻的培养
• 1.3 总RNA与mRNA质量检测
• 2 SSH文库构建
• 2.1 接头效率的检测
• 2.2 差减杂交PCR产物分析
• 2.3 插入片段检测
• 2.4 地高辛杂交检测
• 3 阳性克隆测序结果
• 4 序列对比分析
• 第四章 讨论
• 1 植物激活蛋白
• 2 SSH cDNA文库在水稻基因差异表达研究中的优越性
• 3激活蛋白诱导的水稻差异表达基因
• 结论
• 附录A 溶液配方
• 附录B 中英文专业名词及英文缩写
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介