2N与4N水稻杂种幼胚后代印记研究及胚乳发育相关基因表达分析

论文摘要

基因组印记是指在基因组序列不发生改变的情况下,杂交后代中一些等位基因的表达受到基因组亲本来源的调控,即单方面表达父本或母本基因组的现象。基因组印记属于表观遗传修饰的一种方式,其对物种后代幼胚发育过程具有重要的调控作用。印记表达主要发生在哺乳动物的胎盘和开花植物的胚乳中。植物中印记调控胚乳发育,并影响种子大小。植物异倍性间杂交种子发育的夭折与其胚乳发育异常密切相关,推测可能存在基因组印记的调控作用。由于正常3倍体胚乳中母本与父本基因组为2：1的比例对于胚乳的正常发育是临界比例,推测胚乳中印记的发生可能与其倍性相关。利用不同倍性的亲本之间相互杂交创造不同倍性的胚,可以验证和研究印记产生机制与倍性之间的关系。同时,根据水稻异倍性间正反交胚乳的发育状态的不同,进一步分析胚乳中与印记发生、糊粉层合成、细胞壁合成等相关调控基因的表达,以确定以上发育相关基因的表达是否受到倍性或亲本基因组比例变化的影响,将有助于进一步验证“亲本冲突学说”在水稻中的适应性,为揭示水稻中印记发生与倍性之间的关系奠定基础。与动物基因印记研究相比,植物基因印记研究还不深入,仅在拟南芥、玉米、水稻等作物胚乳中鉴定获得22个印记基因。水稻作为主要的模式植物,无论在生产实践还是基础研究中都具有重要的地位。本实验以我们与CSIRO的Dr.Ming Luo前期合作研究确定的200多条水稻候选印记基因为基础,通过亚种间异倍性水稻杂交(日本晴(2n),海天(2n),D海天(4n)),采用幼肧拯救、倍性鉴定、SSR标记、农艺性状分析、印记表达分析、定量PCR检测技术等方法,研究异倍性杂交后代幼苗中印记发生、农艺性状、胚乳中发育相关基因表达等与倍性之间的关系,主要结果如下：1.无论遗传背景如何,四倍体与二倍体水稻正反交都不能产生正常的种子。杂交种子发育前期与正常种子相比没有明显差异,授粉后5d种子发育趋于停止,授粉后10d种子开始干枯,最终夭折。2.成功获得了授粉后8d、11d、14d的正反交幼胚拯救培养后代。另外,还获得了日本晴(2n)×D海天(4n)授粉后20d的杂交胚拯救后代。说明3n幼胚具有发育成苗的能力,胚乳异常是种子夭折的原因。3.利用分子标记与细胞学压片对获得的拯救幼苗分别进行杂种鉴定和倍性鉴定。总共获得了100多株真实3倍体后代。后代农艺性状调查显示,正反交后代表型差异不明显。4.胚拯救后代幼苗期基因印记表达验证显示,3倍体后代在营养生长阶段不存在基因印记表达。实验将预测获得的印记基因分别对3倍体胚乳和拯救后代进行SNP差异分析,发现在正反交3倍体胚乳中SNP位点处只有来自父本或母本的基因表达,即发生基因印记；而在3倍体胚拯救后代中SNP位点处双亲基因都有表达,从而说明未发生基因印记。5.胚乳发育相关基因表达分析证明：多数基因在异倍性水稻正反交胚乳中表达差异明显。其中Dekl、两个BC家族基因、GW2以及RFC3在4n×2n胚乳中的表达量明显高于在2n×4n胚乳中,说明4n×2n与2n×4n相比胚乳发育程度较高,细胞化提前。然而MSll的表达情况与以上基因相反,说明其表达情况与细胞核分裂以及基因印记有关。此外在不同遗传背景条件下,基因在异倍性正反交胚乳中的表达趋势相同,说明基因表达主要受到胚乳倍性变化的影响。综上,本研究证明了倍性变化和不等的亲本基因组比例不是印记发生的直接原因。成功获得的胚性3倍体后代也间接证明了异倍性间杂交种子败育是胚乳发育失常导致的。另一方面,胚乳发育相关基因表达结果证明了植物异倍性胚乳发育现象：高倍性材料作母本时,胚乳分裂衰退,细胞化提前；相反,高倍性材料作父本时,胚乳分裂旺盛,细胞化推迟。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 一、文献综述
• 1 植物生殖现象及多倍体的进化
• 1.1 植物的双受精现象
• 1.2 胚和胚乳的发育
• 1.3 多倍体的进化
• 2 基因印记的发现及研究进展
• 2.1 基因印记的起源
• 2.2 植物基因印记研究进展
• 2.2.1 植物基因印记的发现
• 2.2.2 植物中的印记基因
• 2.2.3 DNA甲基化对印记表达的调控
• 2.2.4 组蛋白甲基化对印记表达的调控
• 2.2.5 印记基因与倍性杂交的关系
• 2.2.6 植物幼胚的基因印记研究
• 3 胚乳发育相关基因的研究
• 4 本研究的目的与意义
• 二、材料和方法
• 1 实验材料
• 1.1 水稻品种
• 1.2 重要试剂和仪器
• 2 实验方法
• 2.1 田间杂交方法
• 2.1.1 去雄方法
• 2.1.2 授粉方式
• 2.2 幼胚组织培养程序
• 2.3 根尖染色体压片
• 2.4 农艺性状调查
• 2.5 总DNA的提取
• 2.6 SSR分子标记分析
• 2.6.1 PCR扩增
• 2.6.2 电泳检测
• 2.7 总RNA的提取及RT-PCR
• 2.7.1 叶片总RNA的提取及纯化步骤
• 2.7.2 胚乳总RNA的提取及纯化步骤
• 2.7.3 反转录步骤及RT-PCR
• 2.8 实时定量PCR
• 三、结果与分析
• 1 2N与4N水稻正反交种子发育异常
• 2 幼胚拯救获得正常植株
• 3 SSR标记及倍性鉴定拯救后代真实性
• 4 胚拯救后代田间性状调查结果
• 5 胚拯救三倍体后代营养生长阶段不发生基因印记表达
• 6 胚乳发育相关调控基因表达分析
• 6.1 MSI1在不同倍性胚乳中的表达情况
• 6.2 DEK1在不同倍性胚乳中的表达情况
• 6.3 BC家族基因在不同倍性胚乳中的表达情况
• 6.4 GW2基因在不同倍性胚乳中的表达情况
• 6.5 RFC3基因在不同倍性胚乳中的表达情况
• 四、讨论
• 1 印记基因表达与基因组剂量无直接相关
• 2 异倍性胚乳中相关基因表达分析
• 3 小结与展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢