黄瓜异源易位系的细胞遗传学形成机制及其对枯萎病的抗性遗传特点

论文摘要

黄瓜枯萎病是一种毁灭性的病害，但是现有黄瓜资源对其抗性的种内变异严重不足。异源易位系与受体黄瓜亲本杂交亲和，可以直接用来转导外源有用性状，是重要的基因资源。全文从发掘黄瓜枯萎病抗性基因资源的角度出发，以本实验室合成的种间杂交材料Cucumis属双二倍体新种C．×hytivus Chen & Kirkbride、异源三倍体、黄瓜异源易位系AT-04、以及AT-04与黄瓜感病品种CC2所构建的联合世代群体为主要研究材料，研究AT-04的农艺学和细胞学特点以及形成机制；在分离比较黄瓜和C．hystrix Chakr．枯萎病病原菌、评价各种抗性鉴定方法的基础上，分析了AT-04对枯萎病的抗性遗传特点和抗性基因组成的异质性。1黄瓜异源易位系的细胞遗传学形成机制和特性为了提高黄瓜异源易位系染色体的分析精度，采用放线菌酮进行非离体预处理，研究黄瓜有丝分裂染色体的前期行为、中期核型和前中期C-分带。结果表明：前期染色体多成同心圆分布；前中期染色体长3～8μm，单套前期染色体具有21条C-带，包括12条末端带、7条着丝点带、1条中间带和1条随体带；中期染色体长1.56～2.30μm，核型公式是2n=14=12m（2SAT）+2sm，随体在3号染色体的长臂上。为了揭示黄瓜异源易位系形成的机制，分析了双二倍体和异源三倍体的部分同源染色体配对交换特点，结果表明：在双二倍体中，52％花粉母细胞中存在多价体，染色体构型公式为38=0.56Ⅰ+17.36Ⅱ+0.35Ⅲ+0.26Ⅳ+0.046Ⅴ+0.056Ⅵ。在前期Ⅰ到中期Ⅰ两个染色体组之间存在分离，末期Ⅰ约1％的花粉母细胞中有7条1染色体分到一极的现象。在异源三倍体中，在终变期和前期Ⅰ分别有0.22％～0.24％的三价体；在后期Ⅰ和末期Ⅱ出现7条1染色体分到一极的现象。双二倍体、异源三倍体与黄瓜的回交1代杂种中有染色体数为2n=14的植株，表明双二倍体和异源三倍体中的7条1染色体分到一极的分离方式，能形成具有活力的n=7型配子。在双二倍体与黄瓜的回交自交后代HH1-8-1-2中检测到来自C．hystrix的外源DNA片段，证明其是异源易位系。通过部分同源染色体之间的交换以及随后的染色体组分离是黄瓜异源易位系形成的重要机制之一。黄瓜异源易位系AT-04具有小叶、短果、棕色瘤刺、多分枝的特点，形态上偏向C．hystrix，育性与栽培黄瓜相近。细胞遗传学研究发现，AT-04在有丝分裂的中后期至少有1对染色体的姊妹染色单体分离明显滞后。在减数分裂终变期，平均每个花粉母细胞有0.2个四价体、0.05个六价体和0.05个八价体，约30％的花粉母细胞中存在拉十字的染色体。在中期Ⅰ，7个二价体出现分组分布现象，主要以3+2+2形式存在，表明其至少经历了4次染色体易位。前中期C-分带分析发现：AT-04的自交一代（AT-04S1）的4号和5号染色体的带型发生了变化。田间调查表明，易位植株AT-04及其自交一代AT-04S1对枯萎病都具有较高抗性。2黄瓜异源易位系抗枯萎病的遗传特性为了为黄瓜抗枯萎病育种提供具有致病性的尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum），研究从黄瓜枯萎病发病植株上分离出3种镰刀菌属的病原菌：尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌和木贼镰刀菌。尖孢子镰刀菌是黄瓜枯萎病的主要致病菌，其菌株在马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）上能够形成3种不同菌落，大孢子镰刀型，主要有3个隔膜，小孢子为椭圆型，没有隔，产孢细胞为短瓶颈状，单出。分离获得对黄瓜具有致病力的尖孢镰刀菌菌株Foc-W01。为了从病原物角度来考察野生种C．hystrix对黄瓜枯萎病的抗性，比较来自C．hystrix和黄瓜的枯萎病病原物的形态、过氧化物同工酶（POD）酶谱以及致病性的差异。结果表明：2种病原物的PSA培养特性差异明显，POD酶谱的谱带数目不同，来自C．hysrix的尖孢镰刀菌强侵染黄瓜幼苗，尖孢镰刀黄瓜专化型病菌轻微侵染C．hystrix。以黄瓜品种长春密刺、津研4号（CC4）、二早子（CC2）、种间杂交后代HH1-8-1-2、以及部分F2(HH1-8-1-2×CC2)植株为材料，分析评价种子萌发抑制、胚根接种、蘸根接种、灌根接种、过氧化物同工酶电泳等鉴定方法的可靠性。结果表明：采用毒素粗滤液进行种子萌发抑制的方法只能部分反应黄瓜材料的抗性差异；胚根接种鉴定观察出土幼苗发病情况的评价方法在理论上可能具有一定的局限性；蘸根和灌根接种鉴定的方法可以准确区分材料的抗性，但发病潜育期较长；过氧化物同工酶（POD）是比较快速有效的前期辅助鉴定方法。为了探索黄瓜异源易位系对枯萎病的抗性遗传规律，以异源易位系AT-04和高感枯萎病黄瓜品种二早子（CC2）为亲本，构建联合世代群体。结果表明：当以抗性亲本AT-04为母本时，F1、F2、BC1P1、BC1P2的抗性分布适用于1对显性基因控制的遗传模式；当以感病亲本CC2为母本时，抗性分布严重偏离1对显性基因的模式，F1，BC1P1，BC1P2和F2群体的抗性总体都比各自正交方向的低。在正反两个方向的杂交世代中，BC1世代的抗性总体上都比各自的F1世代强。同工酶分析表明：酶带的深浅与植株对枯萎病的抗性强弱成负相关，利用同工酶带的深浅可以区分同一个群体中单株抗性的相对强弱。采用RAPD、SSR和AFLP等技术，评价AT-04对枯萎病抗性的异质性。研究表明：在抗感基因池中，利用报道的与枯萎病抗性相关的RAPD引物不能扩增出预期大小的DNA产物。SSR（CSWCT06A）引物和根据抗性基因同源序列设计的5对简并引物，在抗感基因池中没有扩增出预期的与抗性相关的DNA片段。AFLP（E25／M70）引物在抗病亲本AT-04、C．hystrix、正反杂交F1等抗性群体的基因池中能够扩增出预期大小的DNA片段，但是为显性标记。同时，试验发现RAPD引物AI-5在正交F1的基因池中扩增出一条约1600bp的多态性条带，其在C．hystrix、AT-04、AT-04×CC2中都存在，在CC2×AT-04中不存在。初步认为异源易位系对黄瓜枯萎病的抗性与已报道的抗性异质。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 引言
• 第一部分 文献综述
• 第一章 基于远缘杂交的黄瓜种质资源的创制研究
• 1 特异染色体材料的合成和鉴定研究
• 1.1 二倍体种间杂种
• 1.2 双二倍体种间杂种
• 1.3 异源三倍体
• 1.4 单体异附加系
• 2 利用异源易位系转导外源有用性状
• 3 展望
• 第二章 黄瓜染色体分析及其在渐渗杂交育种中的应用
• 1 染色体分析
• 1.1 有丝分裂染色体鉴别
• 1.2 减数分裂观察
• 2 染色体分析在黄瓜渐渗杂交育种中的应用
• 1和双二倍体'>2.1 种间杂种F₁和双二倍体
• 2.2 异源三倍体
• 2.3 单体异附加系
• 2.4 异源易位系
• 3 展望
• 第三章 黄瓜枯萎病抗病育种的研究进展
• 1 黄瓜枯萎病病原物的研究
• 1.1 枯萎病病菌专化型和生理小种
• 1.2 营养体亲和群（VCG）
• 1.3 同工酶和DNA
• 1.4 致病性
• 2 黄瓜枯萎病抗性鉴定方法
• 2.1 生产应用的接种鉴定方法
• 2.2 试验研究阶段的接种鉴定方法
• 3 黄瓜对枯萎病的抗性机制
• 4 黄瓜对枯萎病的抗性遗传规律
• 5 黄瓜枯萎病抗性基因标记
• 6 展望
• 第二部分 研究论文
• 第一章 黄瓜异源易位系的形成机制和特性研究
• 第一节 放线菌酮预处理黄瓜前中期染色体C-分带技术
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 染色体制备
• 1.3 染色体分析
• 2 结果与分析
• 2.1 前期染色体的行为
• 2.2 前中期染色体的形态和C-分带
• 2.3 中期染色体的核型
• 2.4 前中期C-分带制备的关键因素
• 3 讨论
• 第二节 黄瓜异源易位系形成机制的细胞遗传学分析
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 部分同源染色体的重组交换
• 2.2 外源DNA片段筛选
• 3 讨论
• 第三节 黄瓜异源易位系AT-04的鉴定研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 农艺性状
• 1.3 细胞学分析
• 1.4 枯萎病抗性的田间调查
• 2 结果与分析
• 2.1 农艺性状
• 2.2 染色体观察
• 2.3 前中期C-分带
• 3 讨论
• 第二章 黄瓜异源易位系抗枯萎病的遗传特性研究
• 第一节 黄瓜枯萎病病菌分离鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 培养基
• 1.3 黄瓜枯萎病病原菌的分离
• 1.4 尖孢镰刀菌的确定
• 1.5 尖孢镰刀菌致病性检测
• 1.6 尖孢镰刀菌的保存
• 2 结果分析
• 2.1 枯萎病病原物分离
• 2.2 尖孢镰刀菌形态学特征
• 2.3 野生型菌株Foc-W01的POD酶谱特征
• 2.4 野生型菌株Foc～W01粗滤液的致病性
• 2.5 尖孢镰刀菌病原物的保存
• 3 讨论
• 第二节 来自Cucumis hystrix和黄瓜的枯萎病病菌比较
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 病原物形态比较
• 2.2 2种病原物POD酶谱差异
• 2.3 病原物的致病性
• 3 讨论
• 第三节 对几种黄瓜枯萎病抗性鉴定方法的评价
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 种子萌发抑制鉴定
• 2.2 常规的胚根接种鉴定
• 2.3 蘸根和灌根接种鉴定法
• 2.4 过氧化物同工酶鉴定
• 3 讨论
• 第四节 黄瓜异源易位系对枯萎病的抗性遗传特性研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 不同世代群体的抗性遗传特点
• 2.2 不同世代的POD同工酶特性
• 3 讨论
• 第五节 黄瓜异源易位系枯萎病抗性基因的异质性评价
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 RAPD
• 2.2 AFLP
• 2.3 SSR
• 2.4 简并引物
• 3 讨论
• 全文讨论
• 全文结论
• 论文创新点
• 博士期间发表的论文
• 致谢