嵌合降钙素基因的构建及表达

论文题目: 嵌合降钙素基因的构建及表达

论文类型: 博士论文

论文专业: 海洋生物学

作者: 王玉梅

导师: 张学成

关键词: 嵌合降钙素,藻蓝蛋白,融合蛋白,突变,串联表达,单克隆抗体

文献来源: 中国海洋大学

发表年度: 2005

论文摘要: 降钙素(Calcitonin,CT)是由哺乳动物的甲状腺C细胞或鱼类的后腮体分泌的多肽类激素,由32个氨基酸残基组成,主要参与体内的钙、磷代谢。天然降钙素中,鲑鱼降钙素(sCT)的活性最高,而人降钙素(hCT)的活性相对较低。化学合成sCT用于临床多年,是治疗骨质疏松、Paget’s病、高钙血症和变形性骨炎等的有效药物。为改进重组降钙素的抗原性和活性,我们以人和鲑鱼降钙素为先导,利用化学合成和酶法合成了长111bp的嵌合降钙素(hsCT)基因,该基因编码34个氨基酸的多肽,其中包括14个人源氨基酸,16个鲑鱼源氨基酸。蛋白质软件分析预测,其活性高于hCT,而抗原性较sCT降低。首先利用融合表达载体pGEX,获得了含GST的融合蛋白(GST-hsCT),并证明具有人降钙素的抗原决定簇部分;但在纯化目的蛋白时,无法实现高效率切割。随后,我们利用串联多拷贝策略,以单分子和多聚体两种形式表达了系列降钙素,但表达量仍然偏低。选用安全无毒的藻蓝蛋白的β亚基基因通过一柔性手背与嵌合CT基因融合,构建融合蛋白cpcB-hsC基因,首先在大肠杆菌,先后选用pGEX和pLEX两个系统对该融合基因进行了表达,并对表达的融合蛋白的抗原性及活性进行了测定。同时,还探讨了融合串联形式存在的蛋白表达。在对表达的蛋白进行抗原性研究时发现,本研究最初设计并合成的基因所表达的降钙素虽然具有人降钙素的抗原决定簇部分,但与抗鲑鱼降钙素抗血清仍然具有交叉反应,为探索嵌合降钙素的抗原位点与活性位点,本研究对所构建的融合基因进行了定点突变,并对各突变体的抗原性与活性进行了比较。在对比试验中,对藻蓝蛋白(CPC)基因进行了表达和活性测定,对重组CPC亚基的生物活性进行了初步探讨,同时制备了其单克隆抗体,为CPC的鉴定与纯化提供了方便。在大肠杆菌获得了低抗原、高活性的融合蛋白后,我们又用同源重组的方法将融合蛋白cpcB-hsC基因整合入集胞藻,在集胞藻内获得了表达,尽管表达量只有1%,但具有一定的降血钙作用,

论文目录:

第一章文献综述和立项依据

第一节降钙素的研究概况

1 降钙素的来源

2 降钙素的生物活性与作用机理

3 降钙素的分子结构与生物活性的关系

4 降钙素的临床应用及其制剂

5 降钙素的分子生物学研究

第二节蓝藻分子生物学研究进展

1 蓝藻基因的克隆与基因组研究

2 蓝藻质粒及蓝藻基因工程的载体系统

3 藻胆蛋白及其基因研究进展

第三节研究课题的提出及立项依据

1 嵌合降钙素基因构建及表达研究的提出

2 转基因集胞藻研究的提出

3 藻蓝蛋白脱辅基蛋白表达研究的提出

参考文献

第二章嵌合降钙素基因的设计、合成与克隆表达

第一节嵌合降钙素的分子设计

1 分子设计

2 讨论

第二节嵌合降钙素基因的合成、克隆与融合表达

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第三章融合蛋白CpcB-CT基因的构建及表达

第一节融合蛋白CpcB-CT基因的构建及融合表达

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第二节融合蛋白CpcB-CT基因的独立表达

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第三节降钙素基因的串联表达

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第四节氨基酸定点突变研究sCT的抗原位点与活性位点

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第四章降钙素基因向集胞藻转化的初步探讨

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第五章藻蓝蛋白脱辅基蛋白基因的克隆、表达及其单克隆抗体制备

第一节藻蓝蛋白脱辅基蛋白基因的克隆、表达

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第二节藻蓝蛋白单克隆抗体的制备、鉴定与应用

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

总结

参考文献

致谢

论文发表情况

发布时间: 2005-10-26

嵌合降钙素基因的构建及表达

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