论文摘要
长期以来脑膜被视为是仅具有保护作用的非神经组织,在结构和功能上与脑实质有本质的不同,但在上世纪90年代Mercier等应用形态学方法清晰地勾勒出柔脑膜细胞与脑实质内胶质细胞、神经元之间有网状的复杂联系,从而提出柔脑膜细胞参与脑内某些生理或病理过程的可能性,引发了对柔脑膜功能的深入思考。新近的一些研究发现:脑膜中的柔脑膜细胞（leptomeningeal cells）表达和分泌多种细胞因子和生物活性物质,参与中枢的免疫调节和诱导发育神经元的迁移定位,并与小脑功能的完善及脑内酶屏障的构成密切相关。但是,柔脑膜细胞与神经元生长、分化的关系还存在争议。有研究认为柔脑膜细胞分泌的抑制神经突起生长的因子是神经元损伤后修复的障碍;也有研究指出柔脑膜细胞能分泌神经生长因子等多种促神经突起再生的因子,并作为滋养层支持神经干细胞的体外生长。新近的研究还注意到成年大鼠柔脑膜层有神经干细胞标记物Lex/ssea-1的表达。这些结果提示柔脑膜细胞与神经系统损伤修复、尤其与神经干细胞之间可能存在着某种特殊联系,为进一步探索柔脑膜细胞的功能提供了新思路。针对以上问题,我们以柔脑膜细胞为研究对象,设计了五组实验,从在体和体外细胞培养的角度,结合应用柔脑膜铺片、细胞培养、免疫组织化学染色、免疫荧光标记、BrdU掺入实验、Western blot等研究方法,对柔脑膜细胞可能具有的神经干细胞特性做了初步探讨。第一组实验观察了正常成年以及不同生长发育期大鼠脑内柔脑膜细胞是否表达经典的神经干细胞标志巢蛋白（nestin）;第二组实验在成功建立单纯柔脑膜细胞培养体系的基础上,检测了柔脑膜细胞能否表现出自我更新以及多向分化等神经干细胞的生物特性;第三组至第五组实验分别观察了不同调控因素（白细胞介素-6、抗抑郁药物以及机械损伤）对于柔脑膜来源神经干细胞增殖分化的影响。主要结果有:实验一一、正常成年SD大鼠及Balb/c小鼠的柔脑膜层中均可检测到神经干细胞特异性标记物nestin的表达,但表达水平低,主要局限于脑腹侧及大脑镰两侧的脑膜组织。两种动物柔脑膜组织中阳性细胞的形态与分布存在差异。二、不同生长发育期SD大鼠的柔脑膜细胞中nestin蛋白表达水平随生长发育呈进行性降低。柔脑膜铺片中除nestin/Thy1.1双标阳性的柔脑膜细胞外,也有GFAP/nestin阳性细胞存在。以上结果说明,不同生长发育期SD大鼠的柔脑膜细胞均可表达神经干细胞标志nestin,即具有神经前体细胞的增殖潜能,但此潜能随生长发育而进行性减弱。实验二一、比较脑膜组织在不同培养条件下柔脑膜细胞的纯度,发现以DMEM/5%FCS/5%HS培养时,培养体系中除柔脑膜细胞外,还存在约30%的星形胶质细胞和少量神经元;以DMEM/1%FCS/9%HS培养时,柔脑膜细胞纯度达90%以上,几乎没有神经元沾染。后者继续传代可使其纯度达97%以上,仅有极少数星形胶质细胞存活。结果提示改变培养条件及多次传代是建立单纯柔脑膜细胞体系的有效方法。二、检测单纯培养的柔脑膜细胞是否具有神经干细胞的基本生物学特性。发现:给予含生长因子EGF/bFGF的无血清条件性培养基后,柔脑膜细胞可自我增殖形成神经球样结构,其成球性呈bFGF浓度依赖性;再以胎牛血清诱导分化,可见除Thy1.1阳性的柔脑膜细胞外,还可分化为β-tubulin III、GFAP、RIP阳性的神经元及胶质细胞;并且柔脑膜细胞经多次传代仍可形成克隆球及多向分化,但能力逐渐减弱。以上结果说明,间充质来源的柔脑膜细胞经体外分离培养后能够表现出自我更新以及多向分化等神经干细胞的基本生物学特性,并可分化形成神经元。实验三一、白细胞介素-6（IL-6）可以诱导柔脑膜来源的神经球向神经元及胶质细胞多向分化,并显著提高分化神经元的比例。以多种神经元标记物鉴定分化神经元性质,提示其为5-HT阳性的未成熟神经元。二、免疫细胞化学染色及Western blotting结果均提示,IL-6孵育可显著上调其自身受体（IL-6Rα及gp130）在柔脑膜来源神经球内的表达,为柔脑膜细胞感受IL-6信号并发生应答反应提供了形态学基础。三、上述体系中,IL-6也引起磷酸化ERK1/2及STAT3分子在柔脑膜来源神经球中的表达。而分别给予其特异性抑制剂PD98059及AG490后,发现ERK1/2通路磷酸化的抑制可影响神经球向神经元及胶质细胞的分化,而STAT3通路磷酸化的抑制则以星形胶质细胞分化的受抑为主。同时, STAT3分子磷酸化提示gp130处于活化状态。以上结果说明,细胞因子IL-6可促进柔脑膜来源神经干细胞向神经元分化,而分化神经元呈5-HT反应阳性。IL-6刺激引起了其自身受体及磷酸化ERK1/2及STAT3信号分子在该细胞体系中的表达,提示上述细胞内分子机制可能参与了柔脑膜细胞向神经元、胶质细胞的分化。实验四一、以抗抑郁药物西酞普兰孵育柔脑膜来源的神经球,发现:西酞普兰能够维持神经球的克隆化生长、促进细胞增殖,并引起细胞内ERK1/2、STAT3信号分子磷酸化;以信号通路抑制剂预处理的结果显示,西酞普兰诱导细胞增殖的效应表现为ERK1/2通路依赖性。二、观察西酞普兰孵育对柔脑膜来源的已贴壁分化的神经干细胞的影响,发现:西酞普兰可促进神经干细胞继续分化,并显著上调分化神经元的比例;同时也引起了分化细胞内磷酸化ERK1/2、STAT3分子的表达。以信号通路抑制剂预处理的结果显示,上述体系中神经元和胶质细胞的分化分别表现为ERK1/2或STAT3通路依赖性。以上结果说明,西酞普兰可以诱导柔脑膜来源神经干细胞的增殖,也可促进其向神经元分化。但是调控细胞增殖分化的机制不同,分别表现为ERK1/2通路或ERK1/2及STAT3通路依赖性。实验五一、建立柔脑膜细胞的体外机械损伤模型,检测机械损伤对细胞增殖及逆分化的影响。结果显示:划伤刺激促进了柔脑膜细胞增殖,但不能诱导其表达nestin蛋白;而含生长因子的无血清条件性培养基可诱导损伤细胞形成神经球,后者在血清存在时向神经元及胶质细胞分化。二、观察损伤的柔脑膜细胞对正常星形胶质细胞增殖及逆分化的影响,发现:损伤的柔脑膜细胞可以诱导正常星形胶质细胞增殖并表达nestin,后者也可形成神经球并向神经元、胶质细胞分化。以上结果说明,机械损伤虽然不能直接诱导柔脑膜细胞分化为神经前体细胞,但可以刺激细胞分泌某些活性物质,诱导与之共培养的星形胶质细胞增殖并逆分化为神经前体细胞。并且,细胞微环境对于细胞能否表现出神经干细胞特性具有重要意义。结论本研究从不同的角度证实:起源于间充质组织的柔脑膜细胞能够表现出神经干细胞的基本特性,自我增殖并在适当条件下分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞;不同性质的刺激（细胞因子、抗抑郁药物以及机械损伤等）可调控其增殖分化;神经系统损伤时,柔脑膜细胞可能分泌活性物质而参与诱导脑内内源性神经干细胞的增殖活化。根据以上结果,我们提出了脑膜细胞可能是脑内潜在的神经干细胞的观点。这些初步发现将为我们更加全面、深入地认识柔脑膜细胞的功能奠定了基础,为神经损伤后的干细胞修复提供了新的思路。